发帖
每发1个新帖
可以获得0.5个丁当奖励
回帖

【专题讨论】western 内参选择大讨论 [精华]

只看楼主
页码直达：
直达末页

楼主

丁香园准中级站友

+1 积分
1楼

这个帖子发布于11年零321天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，
看到很多站友对内参的选择经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。

我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。
1。为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。常用的几种内参。
3。不同的情况如何选择不同的内参。
4。。。。。

邀请讨论

搜索

2007-08-02 20:49 浏览 : 60292 回复 : 128

投票 14
收藏 279
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

20021108 编辑于 2007-08-09 13:18

• 呼吸困难来了！

收起全部有料回复

vivian007

铁杆站友

+1 积分
48楼

补充一点选内参的原则：所选的内参与目的基因之间不能有调节关系，否则内参就不客观了，如：你是做与糖代谢相关的基因就不能选GAPDH，与细胞骨架相关的就不能选β-actin。

2007-10-23 21:51

投票 6
收藏 3
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 2019年中医执业医师技能总汇。。大家把题和答案都发这里呀！！

lee800265

肿瘤科

丁香园中级站友

+1 积分
45楼

wxnacata
xray19朋友，你的问题我也同样遇到了，我做的是组织，提取的心肌组织的蛋白做的WB，现在发现正常大鼠的心肌组织beta-actin的条带非常浅，而病变模型的beta-actin条带很明显，开始觉得可能是自己蛋白测定或稀释的时候有问题（虽然自己觉得这种可能性很小），但是还是跑了此普通的蛋白电泳来验证自己的上样量，在普通蛋白电泳图上显示我的蛋白上样量是一致的。那现在说明beta-actin确实在病变的组织中表达量发生变化了，既然这样为什么beta-actin还能作为一个看家基因呢？是不是用GAPDH会好些？如果beta-actin、GAPDH、tublin在某种病变的组织中均发生较大改变了（这种情况有可能，虽然几率很小），那该如何选择内参呢？请教各位在行的朋友，谢谢

actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin，alpha-cardiac muscle actin，alpha-smooth muscle actin，和gamma-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。你所谓的病变可能与心肌的重构有关，肌肉中的肌动蛋白很可能就发生了明显的变化。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了）但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况太少了，如果遇到的时候再具体分析，这个不好说，我认为如果是总蛋白的话可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然我认为这种可能性出现的几率比我买彩票中大奖差不多。今晚回答这个问题对于我来说也是一个考验，很多基础知识都是通过网络和拚命的回忆来的，也算是对于actin这个内参的一个全面了解了，希望有所帮助。

2007-10-22 02:32

投票 4
收藏 4
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 丁香晚间病例-抠痘痘差点引发死亡，这个病例值得所有医生警惕！

xray19

铁杆站友

+1 积分

热

29楼

iris_palm
xray兄，好久没有见到你啦！:O):X
不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。

就比如我上次买了个抗体，说明书上写着检测的smooth muscle isoform的，因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型，所以就买了。
买来后一直不出条带，我纳闷了，于是提取大鼠主动脉组织作为对照，也不出条带。火了，就用了另外个细胞株做对照，条带就出来了，而且很亮，压片时能见到荧光，但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次，大鼠主动脉组织也出过两次条带，但是非常细非常淡，若有若无那种，提高上样量也是这样，以致于根本不能扫描，:(
此公司做抗体是用的是一段合成肽，我比较了两种异构体，只有6，7个AA的差异，
我自己的解释是，这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能检测到smooth muscle isoform。
目前正在与此公司交涉。

哈哈，又见着 palm兄了。摊上老兄你这事，是得好好跟公司说道说道了:!(:!(:!(。

我也在怀疑是公司选用了不合适的抗原片段来制备β-actin抗体（或者，我选用了不合适的抗体:~)），以至于检测产生组织特异性。因为，1，actin几种异构体的确存在组织分布特异性，β-actin分布于非肌细胞中作为骨架蛋白；2，actin几种异构体的氨基酸序列具有较高的相似性（>90%）；3，β-actin要作为内参，得首先保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列:?):?):?)。

问题是我的抗体太久了，查不到是哪个公司的了:(:(:(。这两天有些忙，凑空我再查查公司β-actin抗体的相关信息吧。

=======================================================
补充β-actin抗体的一些信息：
=======================================================
肌动蛋白（actin）是一种重要的骨架蛋白，目前在动物细胞中发现至少有6种亚型存在：“Nonmuscle beta- and gamma-actin, also known as cytoplasmic actin, are predominantly expressed in nonmuscle cells, controling cell structure and motility. alpha-cardiac and alpha-skeletal actin are expressed in striated cardiac and skeletal muscles, respectively; two smooth muscle actins, alpha- and gamma-actin, are found primarily in vascular smooth muscle and enteric smooth muscle, respectively. ”
因此,理论上,特异性针对beta-actin的抗体必然在心肌和横纹肌中检测不到条带.但实际上,因为存在如下问题:
1,不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%).
2,公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原.
因此,可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如,选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测Nonmuscle 细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除Nonmuscle细胞外,还可以检测cardiac,skeletal,smooth muscle细胞的actin.

实际上,公司所制备的beta-actin抗体确实存在上述情况.
1, 选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗).这类的抗体占大多数,主要有santa cruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(Catalog No.: 3779),Cell Signaling(#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等。这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。
相关网址如下：
http://www.cellsignal.com/products/4967.html
http://www.scbt.com/datasheet-69879-beta-actin-ac-15-antibody.html
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/A1978
http://www.prosci-inc.com/Antibody-TDS/3779%20B-actin.html
http://www.axxora.com/actin-related_products-BET-A300-491/opfa.1.1.BET-A300-491.1916.4.1.html

2, 选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体。主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).
相关网址如下:
http://www.axxora.com/actin-related_products-PSC-3777/opfa.1.1.PSC-3777.1301.4.1.html
http://www.epitomics.com/products/1784-1.php
http://www.epitomics.com/products/1854-1.php
这类抗体便可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号.

最为明显的区分可以见Cell Signaling公司和EPITOMICS公司免疫组化的结果(顺请wxq2005fw指教):
http://www.cellsignal.com/products/4967.html
http://www.epitomics.com/products/1854-1.php

2007-08-25 01:18

投票 5
收藏 9
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

xray19 编辑于 2007-08-29 00:55

• 左肾及输尿管改变。

引用回复

蛋白质和糖学

【专题讨论】western 内参选择大讨论 [精华]

提示

丁香园旗下网站

关于丁香园

官方链接

蛋白质和糖学

分享到：

微信扫一扫

【专题讨论】western 内参选择 大讨论 [精华]

微信扫一扫

微信扫一扫

微信扫一扫

微信扫一扫

提示

丁香园旗下网站

关于丁香园

官方链接

【专题讨论】western 内参选择大讨论 [精华]