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【求助】胰蛋白酶（Trypsin）酶解效果不佳,如何解决？

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楼主 dubiantou
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这个帖子发布于13年零311天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
目前正在建立一个蛋白的肽图检测方法（HPLC）,该蛋白分子量为150KD左右,由二硫键连接形成等二聚体。
现采用如下方法处理：用1%NH4CO3对样品透析4h，透析后浓度为1mg/ml，TPCK-Trypsin用1%NH4CO3配制成1mg/ml的溶液；按0.1%的比例加入β-巯基乙醇，以还原二硫键；再以1：20（W/W）比例加入上述胰蛋白酶，37℃条件下酶切24小时；以1：10（V/V）的比例加入1N HCL终止反应；混匀，用0.45μm水相针式滤膜过滤后上样100μl。
但是酶切效果不是很理想，蛋白仍有较多没被降解，但是我查阅相关资料，似乎1：20（W/W）的比例已经足够。那么哪些步骤可以改进以提高酶切效果呢？另外，对于这样的大分子蛋白，如何评价酶解的效果？因为酶解产物太多，几次结果往往不能非常一致。
谢谢！
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2007-04-29 16:27 浏览 : 6095 回复 : 6
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1、最主要的是还原二硫键是可以的，但应该在酶切之后，而不是酶切前。
2、好象你的酶浓度太高了，一般用0.1mg/ml。
2007-05-14 16:46
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楼主 dubiantou
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1、最主要的是还原二硫键是可以的，但应该在酶切之后，而不是酶切前。
2、好象你的酶浓度太高了，一般用0.1mg/ml。

非常感谢"我的密码"的回答。
在这里我说明一下：还原剂和酶都是加在样品中的，所以这第一个应该不是问题所在。
另外我想请教一下：酶浓度高的话有什么不良的影响？我这里把酶浓度调高主要是因为这样加入的酶液的体积较少，以减少对样品终浓度的影响。
我又查了一些资料，这种结构比较复杂的蛋白由于存在空间位阻，往往酶切不是很充分，而且重复性不佳；一般会进行还原处理，所以这个方向是对的；但是由于酶切之后没进行及时的封端处理，巯基重新氧化，可能还存在错配现象，导致酶切仍然不充分、重复性不佳。
所以打算在下面的实验中加入烷基化步骤（即对巯基进行封端处理），进一步的实验结果我会在实验后附在下面。
2007-05-14 17:15
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dubiantou
非常感谢"我的密码"的回答。
在这里我说明一下：还原剂和酶都是加在样品中的，所以这第一个应该不是问题所在。
另外我想请教一下：酶浓度高的话有什么不良的影响？我这里把酶浓度调高主要是因为这样加入的酶液的体积较少，以减少对样品终浓度的影响。
我又查了一些资料，这种结构比较复杂的蛋白由于存在空间位阻，往往酶切不是很充分，而且重复性不佳；一般会进行还原处理，所以这个方向是对的；但是由于酶切之后没进行及时的封端处理，巯基重新氧化，可能还存在错配现象，导致酶切仍然不充分、重复性不佳。
所以打算在下面的实验中加入烷基化步骤（即对巯基进行封端处理），进一步的实验结果我会在实验后附在下面。

如果需要还原巯基，需要对巯基进行烷基化，之后还要把巯基化及烷基化的试剂脱析干净才能再酶切。——因为巯基化试剂和烷基化试剂对酶活力有很大影响的。
如果酶含量高了，会出现酶之间相互酶切降低酶效率。
2007-05-15 14:11
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