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核酸技术

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论坛首页  >  核酸基因技术讨论版   >  载体构建
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【交流】表观组学(epigenomics)的实验技术交流 [精华]

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楼主 xxboy
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这个帖子发布于14年零0天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
“表观遗传学现在成为了肿瘤研究中的热点问题。我们现在已经很清楚肿瘤的形成都伴随着DNA甲基化和组蛋白的修饰异常。全基因组的低甲基化（hypomethylation），抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化(hypermethylation)，众多关键基因的组蛋白密码被改变，以及组蛋白H4去已酰化和三甲基化，这些都是肿瘤细胞异常表观遗传谱的明显特征。、、、，我们有必要建立一个雄心勃勃的计划去认识肿瘤发生中DNA 甲基化和组蛋白变化的本质。人类表观组计划是对这一必要性的响应。“
－－－－－Manel Esteller
CpG岛的最新定义：
1、片断长度≥500 bp（最近略有改动，有文章指出大于200bp），G+C的含量≥50％，CpG二核甘酸的实际观察值与期望值之比≥65％；大约70％的哺乳动物基因组CpG被甲基化，并常发生在重复序列区域；
2、相比较而言，没有甲基化的的CpG往往出现在看家基因和抑癌基因的启动子区域，并在基因的表达调控和细胞分化中起着决定性的作用。
参考：MMASS: an optimized array-based method for assessing CpG island methylation DNA

甲基化通过两种机制参与转录调控：
一、DNA甲基化直接干扰了特异性结合蛋白与该识别序列的结合；
二、组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases, HDAC）或组蛋白甲基化转移酶（Histone methyltransferases）与甲基化位点上的结合蛋白（methyl-CpG binding proteins）的形成牢固、紧缩的核小体结构，间接的抑制基因的表达。

写在开版前。
主要涉及的甲基化的定性检测和定量分析的实验技术：
1、甲基化PCR（Methylation-Specific PCR）；
2、甲基化芯片，如DMH(Differential methylation hybridization)和MeDIP－on－chip(类似CHIP-on-chip)；
3、high performance capillary electrophoresis (HPCE)；
4、Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA)；
//////
推荐一篇review比较全面的介绍了表观组学研究的技术
http://www.springerlink.com/index/P246VJ7375M14453.pdf
*********************************************
在复杂疾病的研究中，特别是精神疾病中，单纯遗传学方面（DNA序列的多态性，包括SNP和去年的CNV）的研究和单纯表观遗传学方面(组蛋白修饰、基因组印记失常、甲基化、小RNA的转录后调控、蛋白的翻译后修饰)都不能给出完全满意的答案。这不禁使人想到了物理学上的光的本质：波粒二相性的问题。
然而，生命体比物理现象还要复杂很多，不能简单得二元化。表型和基因型的桥梁是基因的表达调控，但是这个桥上发生的故事我们了解的还不够完整。生命体是一个高度开放的系统，它的一个很重要的能力就是环境应答，并且作出适应性调整。表观遗传修饰在这方面功不可没。是否遗传学和表观遗传这2个独立的系统存在一个交集？这个交集中大部分是存在着遗传异质性的应答基因？在同样的环境因素下，多态性也可以影响基因的表观修饰从而影响基因调控？
在复杂疾病的模式中，遗传＋环境＋随机因素＝致病，然而，在精神疾病中和一般的躯体疾病如癌症、心脑血管疾病中，这三种因素的比例是否会不同？心理因素对人罹患某种疾病的影响又究竟有多大的影响？也许这需要更多根据临床资料和流行病学调查方面的资料来比较。 (引自一个知己的评论)
**********************************************
希望在表观遗传学领域匍匐前进的战友到此交流！
应用一篇综述上的图片
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2007-01-24 17:27 浏览 : 69862 回复 : 293
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xxboy 编辑于 2007-12-22 20:31
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楼主 xxboy
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甲基化研究方法的“金标准”
亚硫酸盐法+测序，尽管十分准确，但是费时费力，而且在大多数情况下局限用于小片断（<1kb）
这类方法主要有亚硫酸氢钠-限制性酶切法和methylight(Gene-specific approaches).
亚硫酸钠修饰的原理：单链DNA中未甲基化胞嘧啶的第4位氨基，通过磺酸基作用脱氨基，能很易形成鸟嘧啶。5mC虽然也会发生微量脱氨基反应形成胸腺嘧啶，与未甲基化胞嘧啶的脱氨基效率相比，在分析中可以忽略不计。因此，亚硫酸钠修饰反应，可以迅速将甲基化状态的差异转换成碱基差异，使能够在PCR为基础上对各种5mC进行分析，是众多序列特异性甲基化检测方法的基础。
亚硫酸氢钠-限制性酶切法(combined bisulfite restr iction assay, COBRA )
COBRA 法使用能同时扩增甲基化和非甲基化模板的通用引物PCR扩增经亚硫酸氢钠修饰的DNA样品中感兴趣序列，用限制性内切酶识别序列中包含CpG的酶切位点，例如BstUI识别CGCG，Taq1识别TCGA等。如果该CpG甲基化,不会被亚硫酸氢钠修饰，就对酶切敏感；如果未甲基化，CpG位点被修饰成 TpG，对酶切不敏感。作为完全亚硫酸氢钠修饰的对照,应使用在其识别位点不包含CpG的Hsp 9211 酶（酶切位点为CATG），任何被切的位点表示不完全修饰或非对称甲基化；相反，Tru91可提供完全修饰的阳性对照（酶切位点为TTAA）；CCAA不是限制性位点，几乎不被甲基化，完全亚硫酸氢钠修饰应该将它变成TTAA，并被Tru91切割，部分性修饰则没有酶切位点。Hsp9211和Tru91结合, 提供了部分转化或完全转化的阳性对照。COBRA具有简便快捷的特点，但受限于限制性位点，因此不能检测所有的CpG位点。
methylight：methylight是用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)检测甲基化的一种方法。实时定量PCR技术是近几年发展起来的新技术,既保持了PCR 技术灵敏、快速的特点,又具有高通量、重复性、特异性和能够定量初始模板的优点。实时定量PCR 技术是从传统PCR 技术发展而来,其基本原理是相同的,主要不同之处是其定量的体系。PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量。
按照Clark(Clark et al., 1994)的方法：
用酸NaHSO3处理
（参考Frommer,M., McDonald,L.E., Millar,D.S., Collis,C.M., Watt,F.,Grigg,G.W., Molloy,P.L. and Paul,C.L. (1992) A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 1827–1831.）
1.

高通量定性分析－基于芯片技术的甲基化差异杂交
参考一个非常好的PPT：http://140.120.130.8/chencm/lab%20web/speech/Methylation%20GenechipTalk-2005.pdf
该幻灯片的作者的文章：Applications of CpG Island Microarrays for High-Throughput Analysis of DNA Methylation
2007-01-29 15:15
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xxboy 编辑于 2007-02-06 14:14
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楼主 xxboy
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上传一本human press出版社出版的《DNA methylation protocols》，太大了不知道如何怎么办？
http://doi.contentdirections.com/mr/humana.jsp?doi=10.1226/1592591825
DNA Methylation Protocols

Author(s): Mills, Ken I. and Ramsahoye, Bernie H.

Format: Hardcover

DOI: 10.1226/0896036189
2007-03-05 16:06
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zhch1998
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我非常希望能下载这本书，希望LZ能共享到56邮箱好吗？非常感激！
2007-03-09 16:07
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