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PCR技术

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流沙01
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  • 1281楼
各位专家，你好！我是一名分子方面的新手。有个问题想请教大家，还请不吝赐教！
我正在作RT-PCR，可我怎么都没办法重复。换了配液方式，还是不行不知专家们能否帮忙教教怎么配液？
多谢！
2011-12-25 15:35
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桔梗19870902
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  • 1282楼
想问各位高手一下 要做荧光定量pcr 我提取的rna在用dna酶处理过后还需不需要买纯化试剂盒纯化啊
一个老师还是要求我纯化 说防止rna样品中存在dna污染
我也是个新手 很多问题不懂 想向各位同仁请教
2012-07-11 10:36
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健康粒粒米
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  • 1284楼
您好，我是最近接触RT-PCR的，用内参实验cDNA得到条带很好；但是用自行的引物就不成了，跑胶结果只有二聚体存在，而且二聚体高低不一致，不知是何原因？主要想问一下：
1、这种情况下我的引物还能继续使用吗？（因为这个引物是我自己在Primer5.0上设计的，由于各种原因，引物各方面不是最优的，但是在DNA上能扩增出条带）
2、我使用的是试剂市场上买的混MIX Taq酶（不用混MIX，直接加引物，模板就行，方便），内参也是用这种酶做的，这样有影响吗？
3、自行引物PCR结果，只有二聚体，无目的条带，大概有哪些原因？
谢谢各位，希望能帮忙解答！
2013-07-23 18:34
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也潸玉鱼头
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  • 1285楼
请教！最近做RT-PCR检测目的蛋白，结果令我有些疑惑，希望战友们帮忙分析。具体情况如下：
我有四个样本和一个阳性对照，下面两张图片分别是内参actin的20,23和26循环，以及目的蛋白的30,33和36循环


此次实验结果发现两个问题：1.前四个样本的目的蛋白在36循环似乎是出现了，有可能是RNA上样量低（第五个阳性对照目的蛋白表达明显）；2.条带下方白色拖影较重，会不会是因为退火温度60度太低。于是第二次RT-PCR时将样本的RNA量增加了一倍并将退火温度调至62度，但是样本的目的蛋白PCR结果和第一次是一样的，也只在36个循环开始出现且白色拖影并无改善。附图如下：

我的PCR体系用的是TAKARA的绿色mix液，引物也是才定的，之前没有跑过此种目的蛋白。想问的是目的蛋白到底有没有表达呢？为什么白色拖影这么重？灰常捉急！求帮忙分析，谢谢了！
2013-10-07 01:48
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