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PCR技术

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  • 1239楼
windheart
请教各位大虾,我用Trizol提细胞的总RNA,老是提不出来,请问你们具体是怎么提的,一般时间是多长?还有就是引物的Tm值及引物的长度是指加上酶切位点还是不加?急盼回复,谢谢。

具体怎么回事?怎么叫没有提出来?你跑胶了?
Tm值一般不加。
2004-07-09 01:17
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  • 1240楼
shiliang188
各位前辈大家好,我有个问题请教,做RT-PCR也有一段时间啦,所有的目的条带都跑出来了,可唯独内参跑的不理想(我是分开跑的),我的内参用的是b-actin,不知道是怎么回事,请问各位前辈怎么解释这个事情,是不是内参引物设计或合成有问题啊,不过这个引物序列是文献查出来的,不知道各位前辈可否帮我出出注意,盼答复,急+郁闷!谢谢

内参一般来说有一个很广的温度范围都可以P出来,如果内参老出不来,而目的带有的话,考虑内参引物的问题--降解可能性比较大,还有就是,种属没搞错吧?:)
2004-07-09 01:20
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  • 1241楼
我刚来到这个讨论区,准备做RT-PCR,但还有很多不明白的,有几个问题请各位前辈答复:
1 我的蛋白有50多KD,其mRNA也不短啊,能用一般的方法吗?
2 事先提取的总RNA如何保存?
3 最后怎么对原样品中的目的RNA定量?
2004-07-09 09:38
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  • 1242楼
我今天要向全世界欢呼!!!两个月前我模条件出了结果,但之后近2个月怎么也没结果,我重新做了模版,换了TAQ酶,dntp,换引物,试了近100次,天天P!结果今天才发现是BUFFER和DDwater出了问题!这是最不可能出问题的呀!!!可能是污染了!今天结果出来了非常漂亮!我从自己的经验教训中领悟到,实验的任何环节都可能出问题,只是相对难易.不能忽视小的地方,往往会造成实验的彻底失败!希望我的教训对大家有点帮助!祝你们幸运!
2004-07-09 13:41
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