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细胞技术

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推荐一种检测细胞凋亡的方法

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楼主 guigli
guigli
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这个帖子发布于18年零41天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
小弟最近应用Annexin-v-FITC 、PI双染法(流式细胞仪)检测了一种眼部细胞的凋亡,效果不错,试剂也不贵(500RMB 25T),文章准备最近投稿,感兴趣的朋友可以跟我讨论一下经验。欢迎做过这方面的研究的朋友指教!二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
  碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
  方法
  1 悬浮细胞的染色:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反应5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
  2 贴壁培养的细胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
  3 爬片细胞染色:同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
  结果 [图4、图5]
  注意事项
  1. 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。
  2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。



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2002-12-12 12:47 浏览 : 6196 回复 : 17
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楼主 guigli
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  • 3楼
这位战友,你也在湖北吗?这么巧
你说的是binding buffer 吧?就是为了让annexin-v-FITC能与PS最佳结合的缓冲液,不用自己配,试剂盒里有的。好像是理论上讲坏死细胞的细胞膜PS是不会翻转到外层的,所以只能被PI染色,而晚期凋亡细胞才会双染,不知我说的对否?你可以在看一下他们的说明书。
2002-12-16 00:01
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guigli 编辑于 2002-12-16 00:02
  • • 儿童发热在基层医疗卫生机构的规范化诊治
楼主 guigli
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是的,不用客气,相互学习嘛。
你在武昌,汉口or汉阳?
2002-12-16 22:50
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guigli 编辑于 2002-12-16 22:53
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