[资源]western blot 攻略
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Western印迹法
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，
试剂配制：
（一）母液
1.0mol/L Tris·HCl
Tris (MW121.14) 30.29g
蒸馏水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl
7.4 约17ml
7.5 约16m
7.6 约15ml
8.0 约10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1）
丙稀酰胺（Acr） 37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
超纯水至 100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20
Tween20 20ml
蒸馏水至 100ml
混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100mg/ml PMSF）：
1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4 19ml
0.2 mol/L Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸馏水至 2000ml
G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250： 100mg
95％乙醇： 50ml
磷酸： 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸馏水至 100 ml
高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml
10％SDS 100 ml 50 ml
10%AP（过硫酸胺） 50 ml 25 ml
TEMED 5 ml 5 ml
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
10X丽春红染液
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
蒸馏水至 100ml
使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）
1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 ml（通风厨里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml
超纯水至 100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
显影液（5X）
自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠（无水） 22.5g
碳酸钠（无水） 33.75g
溴化钾 20.95g
补水至 500ml
配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。
定影液
自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠（无水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加水定容至1000ml，室温保存
抗体
用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml
化学发光试剂
购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。
操作步骤：
（一） 蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、 按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4、 每瓶细胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用*将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2） 组织中总蛋白的提取：
1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、 加400 ml单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、 弃上清，加入4ml PBS并用*轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、 用*洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二） 蛋白含量的测定
（1） 制作标准曲线
1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。
3、 按下表在各管中加入各种试剂。
0mg 2.5mg 5.0mg 10.0mg 20.0mg 40.0mg
1mg/ml BSA － 2.5ml 5.0ml 10.0ml 20.0ml 40.0ml
0.15mol/L NaCl 100ml 97.5ml 95.0ml 90.0ml 80.0ml 60.0ml
G250考马斯亮蓝溶液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
5、
（2） 检测样品蛋白含量
1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、 取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
（三） SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml*吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
6、 测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15ml，加样孔的最大限度可加20ml样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
（3） 电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
（四） 转膜
（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。
（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。
（五） 免疫反应
（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
（六） 化学发光，显影，定影
（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七） 凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
Western blot analysis-1 Cells were cultured in 199 medium with 10% fetal bovine serum. After digestion with 0.25%trypsin and 0.2%EDTA, the cells were collected and were washed three times with ice-cold PBS, then were lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), the protein concentration of lysates was meatured by Bradford method. 50μg proteins of different groups boiled for 5 min in sample buffer and were separated in 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Nonspecific reactivity was blocked by incubation overnight at 4℃ in buffer(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 2%Tween-20, 4% bovine sreum albumin).The membrane was then incubated with primary antibody. The secondary antibody was used to detected bound primary antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Amersham pharmacia biotech).
Western blot analysis-2 The protein expression ezrin was detected by Western blot method. Confluent 150 cm2 flasks of cells were washed three times with ice-cold PBS, then lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), 50mg of each lysate sample was boiled for 5 min in sample buffer and were separated by 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Pall Corporation). Nonspecific reactivity was blocked in 5% nonfat dry milk in TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20) for 1h at room temperature. The membrane was then incubated with monoclonal antibody of mouse anti human ezrin p81(Maixin-Bio) followed by reaction with anti-mouse IgG-HRP antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Santa Cruz).
ezrin蛋白表达通过Western blot进行检测。已达融合生长的单层细胞用冷PBS洗三次后，加入裂解液(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100)冰上裂解30min，12,000g,5 min离心去除细胞碎片后，取50mg样品与上样缓冲液混合，煮沸5min，进行10% SDS-PAGE电泳，转硝酸纤维素膜(Pall Corporation)。将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)中室温下封闭1h，随后加入鼠抗人ezrin一抗(Maixin-Bio)，抗鼠IgG-HRP二抗，ECL化学发光试剂检测(Santa Cruz)。
不同浓度分离胶的最佳分离范围
SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围
6%胶 50-150kD
8%胶 30-90kD
10%胶 20-80kD
12%胶 12-60kD
15%胶 10-40kD
Western Blot 实验计划完整版
一、SDS-PAGE
1、分离胶的配制
10% 10%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL
去离子水 3.33 mL 4.995mL
分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL
8.00 mL 12.00mL
10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL
TEMED 12μL 18μL
2、压缩胶的配制
3%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 0.75 mL
去离子水 3.00 mL
压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL
5.00 mL
10%(w/v)APS(现用现配) 30μL
TEMED 8μL
先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40min内使用。
3、蛋白样品的制备
蛋白样品 8μL
上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL
煮沸5min
冷却至室温
短暂离心
之后可加样，加样孔的深度至少为5~8mm。
拔出梳子后，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除
从烧水开始，蛋白样品的制备大约需要35min
4、电泳
压缩胶电压：80V（10mA）
分离胶电压：120V（20mA）
当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。
5、染色
考马斯亮蓝染色液35min，摇床摇动（为获得最大分辨率，5%凝胶染色2小时，10%凝胶染色4小时）
用清水反复漂洗几次
高甲醇脱色液25min，摇床摇动（也可用7%（v/v）冰乙酸）
低甲醇脱色液，摇床摇动
二、Western blot
1、润湿
准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜，尺寸与凝胶大小相仿，先放入水中3分钟，放入转膜缓冲液中5分钟。
2、起胶
将凝胶从电泳槽中取出，放入转膜缓冲液中10分钟
3、三明治的制作
按以下顺序放置：3层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层Whatman 3#滤纸
切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。
4、海绵的润湿
用转膜缓冲液将海绵润湿
5、转膜
将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。
1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
6、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）
7、封闭
1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
8、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
9、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
10、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
11、清洗
同13，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
12、显色
按如下配方配制显色液：
1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C
将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。
Considerations:
· Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrence of background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, using an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel.
· Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies. Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibody is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with a different lot or a similar reagent from a different source can provide resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitors can help.
· No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied to the blot.
· Some antibodies will not bind in the presence of detergent; consult the datasheet for each antibody prior to performing any procedure.
本实验所需全部试剂的配方：
SDS-PAGE
一、丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）1000mL
30%(w/v) 丙烯酰胺 300g
0.8%(w/v) 双丙烯酰胺 8g
加去离子水，至终体积1000mL。经0.22μm膜过滤。存于4℃暗处。
二、分离胶缓冲液（4X）
1.5mol/L Tris-HCL(pH8.0)
0.4%(w/v)SDS
500mL 1000mL
Tris-Base 90.8g 181.7g
10%(w/v) SDS 20mL 40mL
加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至8.0。经0.22μm过滤。存于4℃。
三、压缩胶缓冲液（4X）
0.5mol/L Tris-HCL(pH6.8)
0.4%(w/v)SDS
500mL 1000mL
Tris-Base 30.3g 60.6g
10%(w/v) SDS 20mL 40mL
加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至6.8。经0.22μm过滤。存于4℃。
四、电机缓冲液（4X）
0.1mol/L Tris
0.768mol/L 甘氨酸
4000mL 8000mL
Tris-Base 48.8g 96.9g
甘氨酸 230.6g 461.2g
加去离子水，至所需终体积。不必调pH。此比例时Tris碱-甘氨酸的pH应为8.3。室温下存于大容器中。
五、SDS(10%;w/v)100mL
取10gSDS溶于去离子水中，至终体积100mL。室温下存于洁净瓶中。
六、电泳缓冲液（1X）
1/4体积的4X电泳缓冲液与3/4体积的去离子水混合。然后加1/100体积的10%SDS至终浓度0.1%(w/v)SDS。实例如下：
800mL
电极缓冲液 200mL
去离子水 592mL
10%(w/v)SDS 8mL
800mL
七、样品缓冲液(2X)储液
0.25mol/LTris-HCL(pH6.8)
4%(w/v)SDS
20%(w/v)甘油
痕量溴酚兰
配制此溶液时，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白）对缓冲液的污染。
100mL
压缩胶缓冲液（4X） 50mL
SDS(固体干粉) 4g
甘油 20mL
溴酚兰（溶液呈深蓝色） 2mg
加去离子水至100mL终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保SDS于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。
八、含2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X）
用前配制样品缓冲液的工作液，稀释2X样品缓冲液，加入2-巯基乙醇至终浓度为5%（v/v）。例如：
2X样品缓冲液 100μL
去离子水 90μL
2-巯基乙醇 10μL
200μL
九、过硫酸铵（APS）(10%;w/v)
取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。
十、考马斯亮蓝染色液（1000mL）
考马斯亮蓝R250 2.5g
甲醇 454mL
冰醋酸 92mL
去离子水 454mL
经Whatman #1滤纸过滤。
十一、高甲醇脱色液
1000mL 2000mL
甲醇 454mL 908mL
冰醋酸 75mL 150mL
去离子水 471mL 942mL
十二、标准（低甲醇）脱色液
1000mL 2000mL
甲醇 50mL 100mL
冰醋酸 75mL 150mL
去离子水 875mL 1750mL
Western Blot
一、膜转移缓冲液（Transfer buffer）
组分浓度：39mM Glycine, 48mM Tris, 0.037%(w/v)SDS, 20%(v/v)甲醇
配制量：1L
配制方法：1、称量下列试剂，置于1L烧杯中。
Glycine 2.9g
Tris 5.8g
SDS 0.37g
2、向烧杯中加入约600mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3、加去离子水将溶液定容至800mL后，加入200mL的甲醇。
4、室温保存。
二、TBS(5X)
组分浓度：100mM Tris-Base, 0.685M NaCl
配制量：500mL
配制方法：1、称量下列试剂，置于500mL烧杯中。
Tris-Base 0.6075g
NaCl 20.0157g
2、向烧杯中加入约400mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3、调节pH至7.6
4、加去离子水将溶液定容至500mL后，4℃保存。
三、TBST(Washing buffer)
100mL 5X TBS
0.25mL Tween 20
Q.S.to 500mL
四、Blocking buffer(1%BSA in TBST)
20mL 5X TBS
1g BSA
Q.S.to 100mL
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，
试剂配制：
（一）母液
1.0mol/L Tris·HCl
Tris (MW121.14) 30.29g
蒸馏水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl
7.4 约17ml
7.5 约16m
7.6 约15ml
8.0 约10ml
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5：1）
丙稀酰胺（Acr） 37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
超纯水至 100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20
Tween20 20ml
蒸馏水至 100ml
混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100mg/ml PMSF）：
1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4 19ml
0.2 mol/L Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸馏水至 2000ml
G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250： 100mg
95％乙醇： 50ml
磷酸： 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44） 0.877g
蒸馏水至 100 ml
高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩校
10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml
10％SDS 100 ml 50 ml
10%AP（过硫酸胺） 50 ml 25 ml
TEMED 5 ml 5 ml
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
10X丽春红染液
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
蒸馏水至 100ml
使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）
1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 ml（通风厨里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml
超纯水至 100ml
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
显影液（5X）
自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠（无水） 22.5g
碳酸钠（无水） 33.75g
溴化钾 20.95g
补水至 500ml
配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。
定影液
自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠（无水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）
加水定容至1000ml，室温保存
抗体
用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml
化学发光试剂
购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。
操作步骤：
（一） 蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、 按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4、 每瓶细胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用*将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2） 组织中总蛋白的提取：
1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、 加400 ml单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、 弃上清，加入4ml PBS并用*轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、 用*洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二） 蛋白含量的测定
（1） 制作标准曲线
1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。
3、 按下表在各管中加入各种试剂。
0mg 2.5mg 5.0mg 10.0mg 20.0mg 40.0mg
1mg/ml BSA － 2.5ml 5.0ml 10.0ml 20.0ml 40.0ml
0.15mol/L NaCl 100ml 97.5ml 95.0ml 90.0ml 80.0ml 60.0ml
G250考马斯亮蓝溶液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
5、
（2） 检测样品蛋白含量
1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、 取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
（三） SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml*吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
6、 测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15ml，加样孔的最大限度可加20ml样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
（3） 电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
（四） 转膜
（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。
（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。
（五） 免疫反应
（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
（六） 化学发光，显影，定影
（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七） 凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
Western blot analysis-1 Cells were cultured in 199 medium with 10% fetal bovine serum. After digestion with 0.25%trypsin and 0.2%EDTA, the cells were collected and were washed three times with ice-cold PBS, then were lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), the protein concentration of lysates was meatured by Bradford method. 50μg proteins of different groups boiled for 5 min in sample buffer and were separated in 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Nonspecific reactivity was blocked by incubation overnight at 4℃ in buffer(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 2%Tween-20, 4% bovine sreum albumin).The membrane was then incubated with primary antibody. The secondary antibody was used to detected bound primary antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Amersham pharmacia biotech).
Western blot analysis-2 The protein expression ezrin was detected by Western blot method. Confluent 150 cm2 flasks of cells were washed three times with ice-cold PBS, then lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), 50mg of each lysate sample was boiled for 5 min in sample buffer and were separated by 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Pall Corporation). Nonspecific reactivity was blocked in 5% nonfat dry milk in TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20) for 1h at room temperature. The membrane was then incubated with monoclonal antibody of mouse anti human ezrin p81(Maixin-Bio) followed by reaction with anti-mouse IgG-HRP antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Santa Cruz).
ezrin蛋白表达通过Western blot进行检测。已达融合生长的单层细胞用冷PBS洗三次后，加入裂解液(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100)冰上裂解30min，12,000g,5 min离心去除细胞碎片后，取50mg样品与上样缓冲液混合，煮沸5min，进行10% SDS-PAGE电泳，转硝酸纤维素膜(Pall Corporation)。将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)中室温下封闭1h，随后加入鼠抗人ezrin一抗(Maixin-Bio)，抗鼠IgG-HRP二抗，ECL化学发光试剂检测(Santa Cruz)。
不同浓度分离胶的最佳分离范围
SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围
6%胶 50-150kD
8%胶 30-90kD
10%胶 20-80kD
12%胶 12-60kD
15%胶 10-40kD
Western Blot 实验计划完整版
一、SDS-PAGE
1、分离胶的配制
10% 10%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL
去离子水 3.33 mL 4.995mL
分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL
8.00 mL 12.00mL
10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL
TEMED 12μL 18μL
2、压缩胶的配制
3%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 0.75 mL
去离子水 3.00 mL
压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL
5.00 mL
10%(w/v)APS(现用现配) 30μL
TEMED 8μL
先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40min内使用。
3、蛋白样品的制备
蛋白样品 8μL
上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL
煮沸5min
冷却至室温
短暂离心
之后可加样，加样孔的深度至少为5~8mm。
拔出梳子后，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除
从烧水开始，蛋白样品的制备大约需要35min
4、电泳
压缩胶电压：80V（10mA）
分离胶电压：120V（20mA）
当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。
5、染色
考马斯亮蓝染色液35min，摇床摇动（为获得最大分辨率，5%凝胶染色2小时，10%凝胶染色4小时）
用清水反复漂洗几次
高甲醇脱色液25min，摇床摇动（也可用7%（v/v）冰乙酸）
低甲醇脱色液，摇床摇动
二、Western blot
1、润湿
准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜，尺寸与凝胶大小相仿，先放入水中3分钟，放入转膜缓冲液中5分钟。
2、起胶
将凝胶从电泳槽中取出，放入转膜缓冲液中10分钟
3、三明治的制作
按以下顺序放置：3层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层Whatman 3#滤纸
切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。
4、海绵的润湿
用转膜缓冲液将海绵润湿
5、转膜
将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。
1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
6、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）
7、封闭
1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
8、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
9、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
10、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
11、清洗
同13，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
12、显色
按如下配方配制显色液：
1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C
将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。
Considerations:
· Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrence of background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, using an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel.
· Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies. Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibody is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with a different lot or a similar reagent from a different source can provide resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitors can help.
· No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied to the blot.
· Some antibodies will not bind in the presence of detergent; consult the datasheet for each antibody prior to performing any procedure.
本实验所需全部试剂的配方：
SDS-PAGE
一、丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）1000mL
30%(w/v) 丙烯酰胺 300g
0.8%(w/v) 双丙烯酰胺 8g
加去离子水，至终体积1000mL。经0.22μm膜过滤。存于4℃暗处。
二、分离胶缓冲液（4X）
1.5mol/L Tris-HCL(pH8.0)
0.4%(w/v)SDS
500mL 1000mL
Tris-Base 90.8g 181.7g
10%(w/v) SDS 20mL 40mL
加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至8.0。经0.22μm过滤。存于4℃。
三、压缩胶缓冲液（4X）
0.5mol/L Tris-HCL(pH6.8)
0.4%(w/v)SDS
500mL 1000mL
Tris-Base 30.3g 60.6g
10%(w/v) SDS 20mL 40mL
加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至6.8。经0.22μm过滤。存于4℃。
四、电机缓冲液（4X）
0.1mol/L Tris
0.768mol/L 甘氨酸
4000mL 8000mL
Tris-Base 48.8g 96.9g
甘氨酸 230.6g 461.2g
加去离子水，至所需终体积。不必调pH。此比例时Tris碱-甘氨酸的pH应为8.3。室温下存于大容器中。
五、SDS(10%;w/v)100mL
取10gSDS溶于去离子水中，至终体积100mL。室温下存于洁净瓶中。
六、电泳缓冲液（1X）
1/4体积的4X电泳缓冲液与3/4体积的去离子水混合。然后加1/100体积的10%SDS至终浓度0.1%(w/v)SDS。实例如下：
800mL
电极缓冲液 200mL
去离子水 592mL
10%(w/v)SDS 8mL
800mL
七、样品缓冲液(2X)储液
0.25mol/LTris-HCL(pH6.8)
4%(w/v)SDS
20%(w/v)甘油
痕量溴酚兰
配制此溶液时，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白）对缓冲液的污染。
100mL
压缩胶缓冲液（4X） 50mL
SDS(固体干粉) 4g
甘油 20mL
溴酚兰（溶液呈深蓝色） 2mg
加去离子水至100mL终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保SDS于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。
八、含2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X）
用前配制样品缓冲液的工作液，稀释2X样品缓冲液，加入2-巯基乙醇至终浓度为5%（v/v）。例如：
2X样品缓冲液 100μL
去离子水 90μL
2-巯基乙醇 10μL
200μL
九、过硫酸铵（APS）(10%;w/v)
取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。
十、考马斯亮蓝染色液（1000mL）
考马斯亮蓝R250 2.5g
甲醇 454mL
冰醋酸 92mL
去离子水 454mL
经Whatman #1滤纸过滤。
十一、高甲醇脱色液
1000mL 2000mL
甲醇 454mL 908mL
冰醋酸 75mL 150mL
去离子水 471mL 942mL
十二、标准（低甲醇）脱色液
1000mL 2000mL
甲醇 50mL 100mL
冰醋酸 75mL 150mL
去离子水 875mL 1750mL
Western Blot
一、膜转移缓冲液（Transfer buffer）
组分浓度：39mM Glycine, 48mM Tris, 0.037%(w/v)SDS, 20%(v/v)甲醇
配制量：1L
配制方法：1、称量下列试剂，置于1L烧杯中。
Glycine 2.9g
Tris 5.8g
SDS 0.37g
2、向烧杯中加入约600mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3、加去离子水将溶液定容至800mL后，加入200mL的甲醇。
4、室温保存。
二、TBS(5X)
组分浓度：100mM Tris-Base, 0.685M NaCl
配制量：500mL
配制方法：1、称量下列试剂，置于500mL烧杯中。
Tris-Base 0.6075g
NaCl 20.0157g
2、向烧杯中加入约400mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3、调节pH至7.6
4、加去离子水将溶液定容至500mL后，4℃保存。
三、TBST(Washing buffer)
100mL 5X TBS
0.25mL Tween 20
Q.S.to 500mL
四、Blocking buffer(1%BSA in TBST)
20mL 5X TBS
1g BSA
Q.S.to 100mL
12 46 7
