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【原创】胰岛分离、纯化和活率、功能检测方法讨论 [精华]

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楼主

dongwp

内分泌科

丁香园管理员

+1 积分
1楼

这个帖子发布于15年零102天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

从事糖尿病研究的实验离不开胰岛细胞，然而，胰岛分离是组织细胞分离中最困难的，不仅各种动物的胰岛分离方法不同，同一动物胚胎与成年的分离方法也不同，稍有偏差就可能导致“颗粒无收”。本人将做过的各种动物胰岛分离、纯化及胰岛细胞的活率、功能检测方法陆续报告给大家，希望与有兴趣的XDJM相互交流。本人将持续关注本帖，望大家给以支持。

大鼠胰岛细胞分离与纯化
1.成年雄性SD大鼠，8～10周龄，体重250～300g，10%戊巴比妥钠40mg/kg肌肉注射麻醉。
2.固定四肢成仰卧位，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管。
3.1号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎，胆总管内插入4.5-5号头皮针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5mg/ml胶原酶p溶液8～10ml（视个体大小而定），使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置6ml Hank,s液的消化瓶中。
4.38℃水浴中静止消化10分钟，取出置于冰浴中用眼科镊撕碎胰腺，（消化熟练后可免去此步，直接振摇。此步可了解消化的情况，很容易撕碎的表示已达到消化的要求）。移入消化瓶中振荡15秒使其呈细砂状，加入4℃新生牛血清10ml与4℃Hank,s 液30ml终止消化。
5.用不锈钢网（600μm）过滤，细胞悬液用50ml离心管1000 rpm 4℃离心2分钟，弃去上清液，沉淀物加入4℃ Hank,s 液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷Hank,s 液重悬后均分到2根15ml离心管内，1000 rpm 4℃离心2分钟，弃去上清液。
6.沉淀物加25%Ficoll 4ml混匀，其上依次分别加入23%、20%、11%Ficoll溶液和Hank,s液各2ml，3000rpm，4℃离心20分钟，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰岛，用4℃Hank,s液于50ml离心管内离心洗涤2次备用。

胶原酶P配制：在D-Hank,s液中加入7.5mmol/L CaCl2、10mmol/L HEPES、0.2%酚红指示剂，用NaON调PH值（7.8）后储存。临用时取上述配制好的溶液按0.5mg/ml加入腺原酶P，0.22um针头滤器过滤除菌后使用。

Ficoll400配制：
1、Ficoll 100g+Hank,s溶液200ml，完全溶解后加Hank,s至400ml即为25%Ficoll溶液。
2、25%Ficoll 92ml+Hank,s 8ml 即为23% Ficoll溶液。
3、25%Ficoll 80ml+Hank,s 20ml 即为20% Ficoll溶液。
4、25%Ficoll 44ml+Hank,s 56ml 即为11% Ficoll溶液。

谢谢dongwp老师的热心帮助和及时有效的回帖。
请各位战友在提问前先去翻一下本版的电子书《胰岛分离与纯化技术手册》，避免重复提问，谢谢。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=92&id=7252533&sty=1&tpg=1&age=0

版主优优行医留言:
谢谢董管一直以来对内分泌版的帮助，
望战友勿忘投票，以示感谢。
望各位战友遵循版内规定，勿留邮箱，详看版内战友必看帖系列，谢谢合作

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2005-10-10 15:25 浏览 : 122148 回复 : 1821

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优优行医编辑于 2015-04-26 19:57

• 新方法可通过手机来检测SARS-CoV-2

clsun213

内分泌科

铁杆站友

+1 积分
2楼

您好，您的方法与我的分离方法基本一致，但是剂量的选择我有点疑问，
首先胶原酶选择的是胶原酶P，但是胶原酶P是选用在狗和人的胰岛细胞分离，当然效果不会有很大差别，但是明明厂家生产时已经分了使用的类型，为何选择胶原酶P。浓度您选择的是0.5mg/mL 我是选择0.75mg 或0.8mg/mL 。滤器选用20目的也就是200微米的吧？但是比他大的胰岛细胞呢？我选择35目，剃度分成写的不明，请问放Hanks是什么时候？我理解的是选用1.10 1.085 1.069 1.037的剃度分成，还有离心速度我是在最高2500rpm，20分钟。谢谢您的阅览。

2005-10-10 19:48

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• 调查：你们医院发年终奖吗？

铁杆站友

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3楼

clsun213
您好，您的方法与我的分离方法基本一致，但是剂量的选择我有点疑问，
首先胶原酶选择的是胶原酶P，但是胶原酶P是选用在狗和人的胰岛细胞分离，当然效果不会有很大差别，但是明明厂家生产时已经分了使用的类型，为何选择胶原酶P。浓度您选择的是0.5mg/mL 我是选择0.75mg 或0.8mg/mL 。滤器选用20目的也就是200微米的吧？但是比他大的胰岛细胞呢？我选择35目，剃度分成写的不明，请问放Hanks是什么时候？我理解的是选用1.10 1.085 1.069 1.037的剃度分成，还有离心速度我是在最高2500rpm，20分钟。谢谢您的阅览。

"滤器选用20目的也就是200微米的吧？但是比他大的胰岛细胞呢？"
目数越小代表的孔径越大,20目代表840微米,35目代表500微米.

2005-10-10 22:50

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• 「考研树洞」第一弹：大龄考研你怎么看？你身边有大龄考研的吗？

clsun213

内分泌科

铁杆站友

4楼

谢谢，JJ 给我的建议。
我建议楼主，写的再详细一点，这样会激发大家的热情。
支持您！！

2005-10-11 10:45

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