● 发表期刊：Cell

● 影响因子：38.637

● 发表时间：2021.01

一、导语

2021年1月9日，顶级学术期刊Cell在线发表了由西湖大学生命科学学院郭天南团队和华中科技大学同济医学院附属协和医院的胡豫、夏家红等研究人员共同完成的研究论文，绘制了2020年初因新冠肺炎去世的逝者体内多组织蛋白质分子病理全景图，有助于深入认识新冠致死机理，及时进行精准的干预治疗。这是在全球范围内第一次从蛋白质分子水平上，对新冠病毒感染人体后多个关键组织做出的响应进行了详细和系统的分析，为临床工作者和研究人员制定治疗方案、开发新的药物及治疗方法提供了线索和依据。

二、摘要

COVID-19多组织损伤的分子病理学仍不清楚，阻止了有效治疗方法的发展。该研究对COVID-19逝者尸检样品进行多组织蛋白质组学研究，通过对7个组织（即肺，脾，肝，心脏，肾脏，甲状腺和睾丸）的蛋白质组进行综合分析，鉴定了11,394种蛋白质，其中5336种在COVID-19与对照组相比有显著差异。COVID-19肺部CTSL显著上调（而非ACE2），在多个组织中检测到蛋白质翻译，葡萄糖代谢，脂肪酸代谢失调。表明在SARS-CoV-2感染后，可能引发过度炎症，进而引起肺中气体交换屏障的破坏，从而导致肺，肾脏，脾脏，肝脏，心脏和甲状腺的缺氧，血管生成，凝血和纤维化。Leydig细胞减少，胆固醇生物合成抑制和精子活性降低表明睾丸损伤。总之，这项研究描述了COVID-19逝者多组织蛋白质组学概况，以及未发现的失调的蛋白质和生物学过程，提供新的治疗线索。

三、研究思路

四、研究结果

1.蛋白质组学概况

对来自19例COVID-19逝者7种组织共144个样本进行TMT蛋白质组学检测，其中肺（N = 15，n = 30；N代表逝者数，n代表样本数），脾脏（N = 9，n = 9，白髓，N = 8，红髓，n = 8），肝脏（N = 10，n = 24），肾脏（肾皮质，N = 10，n = 18，肾髓质，N = 9，n = 16），心脏（N = 9，n = 19），睾丸（N = 5，n = 5）和甲状腺（N = 15，n = 15）。以来自56例非COVID-19对照的74份组织样本作为对照。所有19名COVID-19逝者均死于SARS-CoV-2肺炎或呼吸衰竭，其中7例发展为终末多组织衰竭。总共鉴定到11394种蛋白质（肽段和蛋白质水平FDR<1%）。在7种组织中，鉴定出的蛋白质数量范围从5828（心脏）到9544（肾脏）。随机选择37个技术重复样本，以及每个TMT批次共18个对照混样，在这些技术重复样品和对照样品中定量的蛋白质分别显示出较低的中值变异系数（CV，6.88％和2.47％）。COVID-19与对照组之间7种组织共鉴定出5336种显著差异蛋白质（Benjamini＆Hochberg（BH）校正后的p值<0.05和| log2（倍数变化）|> log2（1.2）），脾脏红髓样本未不进行后续分析（无统计学显著差异）。来自每种组织类型的差异表达蛋白的层次聚类热图表明，这些蛋白很好地区分COVID-19和对照。除睾丸外，其他6种组织类型只有27种蛋白质共同差异表达，表明不同组织通过多种途径反应。其中，急性炎症蛋白，C反应蛋白（CRP）和M2型巨噬细胞高表达标志物，富含半胱氨酸清道夫受体1型M130（CD163）是上调程度最高的蛋白，可能反映了因COVID-19死亡的患者过度炎症和修复状态。

蛋白质组学概况

2.SARS-CoV-2感染相关的6类蛋白质

重点研究了6类蛋白质，包括病毒受体和蛋白酶，转录因子（TF），细胞因子（及其受体），凝血系统，血管生成相关蛋白以及与SARS-CoV-2感染相关的纤维化标记物。在受体和蛋白酶介导进入细胞后，SARS-CoV-2劫持了宿主翻译机制并通过TF诱导了宿主的炎症反应，从而导致了过度炎症状态，这可能与临床上观察到的血液高凝性有关，经病理学家检查的纤维化和微血栓形成，以及通过COVID-19肺的形态学和基因表达检查报告的血管生成增强。蛋白组结果显示COVID-19 TF的实质性调节，在至少一种组织类型中，1117个TF中有395个发生了变化，并且在剪接体，病毒致癌等方面显著丰富。通过倍数变化与IPA预测激活状态相匹配，这些失调的TF中有10个显示出相同的变化趋势，参与了COVID-19患者的过度炎症，缺氧状态和组织损伤。在242种细胞因子中，有112种显著变化并与血管生成，生长因子反应和其他途径相关。烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT），糖皮质激素受体（NR3C1）和干扰素-γ受体1（IFNGR1）在大多数组织中显著变化。NAMPT参与多种信号途径，例如IL6-STAT3和NF-κB，除了睾丸外，在6个组织中均上调。NR3C1参与抗炎过程，除了睾丸和甲状腺外，在其他5个组织中均下调。IFNGR1会在病毒感染后触发宿主免疫反应，除了睾丸和甲状腺外，在5个组织中均上调。

蛋白组数据确定了6种已报道潜在的病毒进入受体或蛋白酶，即血管紧张素转化酶2（ACE2），C型凝集素结构域家族4成员M（CLEC4M） 和成员L（CD209），Niemann-Pick C1（NPC1），癌胚抗原相关细胞粘附分子1（CEACAM1）和组织蛋白酶L1（CTSL）。ACE2是已知的介导SARS-CoV-2进入的受体，在肺中并未显示出明显的调节作用，但在COVID-19肾脏和心脏中的表达均下调。ACE2对血管紧张素II的调节作用（包括炎症，血管收缩和血栓形成）支持了这一观察结果；CTSL是SARS-CoV-2内体途径中丝氨酸蛋白酶，在肺中显著上调，可能为COVID-19的潜在治疗靶标。在SARS-CoV感染细胞模型中，已证明CTSL抑制剂可有效阻止病毒进入。

SARS-CoV-2感染相关的6类蛋白质

3.多组织凝血，血管生成和纤维化

蛋白组数据表明COVID-19系统性凝血，血管生成和纤维化失调。在COVID-19肺和肾脏中观察到了微血栓，与实验室标记物（如D-二聚体）相符，表明处于血栓形成前状态。参与凝血，抗凝和纤溶系统的失调蛋白可能会导致COVID-19的凝血障碍。总共139种与血管生成相关的蛋白严重失调，多组织异常血管生成（不仅在肺部）可能是由于凝血异常，组织缺氧和COVID-19中细胞因子过度刺激引起。由于已在COVID-19肺部观察到纤维化，通过与报道的潜在纤维化标记物进行匹配分析数据中29种与纤维化相关的蛋白质。丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPINE1）和几丁质酶 3 样蛋白 1（CHI3L1）在大多数COVID-19组织中上调。在COVID-19样品中鉴定了179种失调的蛋白质，参与纤维化的四个阶段，即启动，炎症，增殖和修饰。通过String数据库和Cytoscape软件分析蛋白质互作，发现这些蛋白质形成了447种相互作用。与纤维化过程相关的失调的蛋白质大部分在肺中，与病理观察一致。上述结果可能在临床上对恢复后监测COVID-19患者的组织纤维化延迟发展具有指导意义。

多组织凝血，血管生成和纤维化

4.蛋白质翻译，葡萄糖和脂肪酸代谢失调

为了获得对5336显著差异蛋白质参与的生物学过程的系统理解，使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）在每种组织类型中进行了途径富集。显示了7个组织中最富集或失调的途径（-log10（p值）> 10或比值> 0.35或绝对（Zscore）> 5）：EIF2信号传导参与mRNA表达的调节，据报道该蛋白受病毒感染的影响。肺，肝和甲状腺具有相似的mRNA翻译模式，尽管几乎没有证据表明肝或甲状腺直接感染了病毒。大多数肺特异的差异蛋白质属于铜蓝蛋白表达的L13a介导的翻译沉默，据报道这是病毒感染后的先天免疫机制。观察到多种代谢过程抑制，包括糖原分解，半乳糖降解和糖酵解。相比之下，大多数组织都激活了脂肪酸β氧化（FAO）和氧化磷酸化，表明已转换为高效的能量生成模式，以支持肺中病毒复制和肝脏中mRNA的翻译。此外，FAO失调和氧化磷酸化还导致活性氧（ROS）的过量生成和促凋亡蛋白的释放，从而诱发肝脏坏死。在肾脏中，FAO被抑制，是导致急性肾损伤（AKI）诱导的肾纤维化的原因之一，大多数COVID-19都检测到了AKI。

蛋白质翻译，葡萄糖和脂肪酸代谢失调

5.组织间交流

根据蛋白质组学数据分析COVID-19组织间交流。肺是SARS-CoV-2攻击的主要目标，COVID-19肺蛋白质组显示了独特的途径富集，这些途径与病毒感染相关，包括mRNA衰减和翻译阻断。此外，病毒的双链RNA（dsRNA）和未加帽的mRNA充当病毒病原体相关分子模式（PAMP），通过细胞质中的模式识别受体（PRR）识别而触发先天免疫应答。通过与之前研究SARS-CoV-2蛋白相互作用图进行比较，只有12种病毒-宿主相互作用蛋白仅在肺中失调，包括应激颗粒相关因子G3BP1，线粒体蛋白TIM10，转录调节因子eIF4H， RING型E3泛素连接酶MIB1，促炎性细胞因子受体IL17RA和Cullin RING E3连接酶2复合物ZYG11B，这些蛋白质可促进病毒复制，抑制宿主mRNA表达，通过病毒核孔复合体介导病毒DNA的传递，参与肺纤维化并降解病毒限制因子。脾脏和肺部表现出相似的免疫反应模式，脾脏中的T细胞衰竭和单核细胞生物标志物的上调表明过度炎症，可能破坏了气体交换屏障的完整性并引起了缺氧，低氧状态会进一步刺激炎症反应。使用免疫组织化学（IHC）进一步检查了脾脏样品中各种免疫细胞的多种标记，发现CD3，CD4，CD8和CD20的IHC染色显著减少了T和B淋巴细胞的数量，特别是COVID-19白髓样本。通过IHC分别对CD68和CD163进行染色，COVID-19红髓中的巨噬细胞数量，M2巨噬细胞数量增加。这些发现与蛋白质组数据一致。此外，血液循环中的细胞因子和免疫细胞可在肝脏中诱导急性期反应和NF-κB信号传导，从而导致血管通透性过高和心脏血管性水肿。在甲状腺和肾脏中，还发现了炎症浸润以及激活的炎症相关信号和蛋白质。

蛋白表达热图

蛋白网络图

6.睾丸损伤

与其他组织相比，睾丸中差异表达蛋白的数量可忽略不计，仅10种蛋白质下调。 胰岛素样因子3（INSL3）是Leydig细胞中表达最丰富的蛋白质，也是COVID-19睾丸组织中蛋白质表达下调最大的蛋白质，表明Leydig细胞功能受损或Leydig细胞数量减少。组织学检查显示Leydig细胞减少，与先前的病理报告一致。发现了5种与胆固醇生物合成有关的下调蛋白质，所有类固醇激素（包括睾丸激素）均来自胆固醇。动力蛋白调节复合蛋白7（DRC7），精子运动性因子的下调提示精子活动性受损。

睾丸损伤 五、研究结论 通过对COVID-19逝者7种组织中的11394种蛋白质进行定量，鉴定出5336种蛋白质显著差异。该蛋白质组图谱揭示了COVID-19中调控的多种生物学和病理学过程，包括免疫应答，蛋白质翻译，凝血障碍，血管生成和纤维化过程。在SARS-CoV-2感染后，多个器官之间的交流进一步将由过度炎症环境引起的上述过程与组织缺氧联系在一起。这项系统的蛋白质组学研究为改善对SARS-CoV-2感染的分子发病机理的理解提供了丰富的资源，并为治疗提供了线索。这项研究受到样本量的限制。此外，将来需要对干扰途径和指定疗法进行深入研究。 六、参考文献 Multi-organ Proteomic Landscape of COVID-19 Autopsies. Cell. 2021.