Dissimilarity of the gut-lung axis and dysbiosis of the lower airways in ventilated preterm infants

机械通气早产儿肠-肺轴的差异和下呼吸道的微生态失调

各种微生物（细菌、真菌乃至原虫）经常从不同环境进入人或动物体，并能在一定部位定居和不断生长、繁殖后代，这种现象通常称为“细菌定殖”。

去污染（decontamination）就是人为地将机体的正常菌群或已定殖的细菌，部分或全部去除的一种防止感染措施，一般可分为全部去污染和选择性去污染两个类型。

全部去污染 为了防止手术后感染，在术前常常先给病人施用各种强力的广谱抗生素，

选择性去污染 选择性去污染就是采用窄谱抗生素，

Chronic lung disease of prematurity ，又称支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)，(1)患儿氧依赖持续至出生后28天以上。

(2)氧依赖在胎龄小于32周的患儿持续至矫正胎龄(PMA) 36周，大于32周的患儿持续至出生后56天

轻度:依赖氧浓度21%。

中度:依赖氧浓度22%-29%,

重度:依赖氧浓度)30%或持续气道正压通气或机械辅助通气。

(2)早产儿慢性肺部疾病治疗大全

激素类药物

医生口中的“激素类药物”一般情况下在没有特别指定时，是“肾上腺糖皮质激素类药物”的简称。其他类激素类药物，则常用其分类名称，如“雄性激素”、“胰岛素”、“生长激素”等。

激素（如强的松、甲基强的松龙等）是一类应用广泛、治疗效果显著的药物。但同时，由于药理作用复杂，如若应用不当，也会带来各种不良反应。因此，有人将激素形象地称为“双刃刀”。原则上应尽量小剂量短疗程治疗。

 gut-lung axis：肠道与肺部间免疫相关性(肠-肺轴)

婴幼儿的肠道菌群可对未来的肺部健康造成影响，影响因素包括早产、分娩方式、喂养方式、感染、抗生素、肠道环境；

菌群通过肠道及呼吸道上皮细胞渗透进入婴幼儿身体完成定殖，并由此产生对病原体的抵抗力；

肠道菌群失调可引起婴幼儿的免疫反应改变，进而通过肠-肺轴影响如肺囊性纤维化变性（CF）等肺部疾病的发展；

Inter-Organ Relationships among Gut, Lung and Skin beyond the Pathogenesis of Allergies: Relevance to the Zang-Fu Theory in Chinese Medicine

中医脏腑理论与现代肠-肺轴及肺-皮肤轴理论似相通

中医的脏腑理论描述了大肠与肺、肺与皮肤之间的关联，与现有的肠-肺轴、肺-皮肤轴的观点相似

Sample Collection 样本收集

DNA Extraction, Bacterial Load and Sequencing

Data Analysis 数据分析

Results 结果

FASTQ是一种存储了生物序列（通常是核酸序列）以及相应的质量评价的文本格式,Illumina测序仪

Table 1 – Demographics of recruited preterm infants from two sites

从两个地点招募早产儿的人口统计数据

两个地点：UHW – University Hospital Wales, NBT – North Bristol Trust.

Necrotizing Enterocolitis NEC Grades 新生儿坏死性小肠结肠炎分期

Bell’s staging criteria 采用修正的贝尔NEC分级标准,

新生儿坏死性结成年可以分为三期。

一期的症状比较轻，表现为腹胀、肠道充气、心跳比较缓慢等；

二期的症状与一期相似但会出现吐血或者便血的情况；

三期的症状非常严重，会出现呼吸衰竭、肠穿孔、血压下降的现象。

Chronic lung disease severity：新生儿慢性肺病严重程度，分四级

None   Mild轻微 Moderate中等 Severe/Died严重

Antenatal steroids 产前类固醇

产前皮质类固醇 Antenatal Corticosteroids，医生可能会给产前使用的两种皮质类固醇是倍他米松和地塞米松

Maternal antibiotic in labour 分娩时产妇抗生素

FDA关于孕产妇用药的分级标准：美国食品和药物管理局根据药物对胎儿的致畸情况，将药物对胎儿的危害等级分为A、B、C、D、X 5个级别：

Surfactant administration 表面活性剂给药

可改善新生儿重症监护病房中呼吸窘迫综合征早产儿的预后

超早产儿生后早期使用持续气道正压通气(CPAP),必要时选择性使用PS的方法较预防性使用PS,可减少肺支气管发育不良(BPD)的发生率及病死率

呼吸窘迫综合征; respiratory distress syndrome(RDS); preterm infants; 早产儿;pulmonary surfactant(PS); 肺表面活性物质; continuous positive airway pressure(CPAP)持续气道正压通气

Survival to discharge 生存至出院

Non-invasive ventilation 无创通气

Patent ductus arteriosus 动脉导管未闭

胎儿期的血液循环和出生后是不一样的。在胎儿期，动脉导管是胎儿存活的重要生命通道。一般情况下，出生后数小时到数周，随着血液中氧浓度的升高和肺血管阻力的下降，失去作用的动脉导管会自动闭合，如若未闭合，则可能会造成心肺负担增加、肺动脉高压等不良后果，成为一种所谓的先天性心脏病。

the difference was not statistically significant 差异无统计学意义

统计学上认为这个结果“不显著”。

如是在检验一个问题的结果是不是，如果结果不显著，那么就说这个在统计学上不显著，即“无统计学意义”。

统计学意义是指在研究组和对照组间出现疗效差异时，要考虑这种差异是防治措施的疗效还是因抽样误差所引起的。差异有统计学意义时，并不意味着有临床意义，而当具有临床意义时可无统计学意义。

Figure 1 - Total bacterial load in the airways and gut in preterm infants

图1—早产儿气道和肠道细菌负载量

the 16 rRNA gene could be successfully amplified

能成功扩增出16 rRNA基因

chimeric sequences were removed 嵌合体序列

PCR过程中，大概有1%的几率会出现嵌合体序列，所以在16S 扩增子测序的分析中，需要去除嵌合体序列

Figure 2– Microbiome analyses for each sample site shown by phyla

Phyla (生物分类学的) 门 phylum的复数

菌门所示每个样品位点的微生物分析

relative abundance 相对丰度？？？

operational taxonomic units (OTUs) 操作分类单元。通过一定的距离度量方法计算两两不同序列之间的距离度量或相似性，继而设置特定的分类阈值，获得同一阈值下的距离矩阵，进行聚类操作，形成不同的分类单元。

按照16sDNA测序结果计算遗传距离，人为规定遗传距离，然后依此距离区别微生物类群的分类单位，根据基因测序结果对微生物进行分类的方法，它是微生物遗传学很重要的概念

OTU聚类的方法多种多样，如Uclust、cd-hit、BLAST、mothur、usearch和 prefix/suffix，这些聚类方法均可以在QIIME软件中实施。不同聚类方法基于不同的算法，得到的聚类结果虽然不同，但是大体的聚类流程都是一致的：

对微生物群落进行测序包括两类：

一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；

还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源

Proteobacteria 变形杆菌 actinobacteria放线菌 bacteroidetes拟杆菌 fusobacteria梭杆菌

tenericutes 软壁菌门;柔膜菌门;软皮菌类;厚壁菌门

Planctomycetes 浮霉状菌 firmicutes拟杆菌门

Online Figure 1 – Averaged microbiome data for each sample site shown by phyla

在线图1 - 按菌门显示的每个采样点的平均微生物组数据

Figure 3 – Microbiome analyses for each sample site shown at genus level

图3-在属级水平上显示的每个采样点的微生物组分析

Staphylococcus葡萄球菌Klebsiella克雷伯菌属Escherichia大肠杆菌Enterobacteriaceae_unclassified 肠杆菌科_未分类

Enterococcus肠球菌属Serratia沙雷氏菌屬;沙雷氏菌;

Escherichia/Shigella大肠杆菌/志贺氏菌Acinetobacter不动杆菌属;

Bifidobacterium双歧杆菌，Mycoplasma支原体属;霉浆菌;Ureaplasma脲原体属;Bacteroides拟杆菌属Corynebacterium棒状杆菌属Streptococcus链球菌Veillonella韦荣球菌属Pseudomonas假单胞菌属Citrobacter柠檬酸杆菌Morganella摩根氏菌Pasteurellaceae_unclassified巴氏菌科_未分类Prevotella普雷沃菌

界>门>纲>目>科>属>种

最大是界包括非细胞生物（病毒）、原核生物、原生生物、植物、真菌、动物6界

 Kruskal-Wallis test 克鲁斯卡尔-沃利斯检验用于多个连续型独立样本的比较。方差分析程序关注的是，几个总体的均值是否相等。数据是间隔测量尺度或比率测量尺度的数据。

仅仅要求顺序(排序)测量尺度数据的非参数检验。不需要对总体分布形态做任何假定。

FDR (false discovery rate)，中文一般译作错误发现率。在转录组分析中，主要用在差异表达基因的分析中，控制最终分析结果中，假阳性结果的比例

FDR的计算是根据假设检验的P-value进行校正而得到的。一般来说，FDR的计算采用Benjamini-Hochberg方法（简称BH法）

Figure 4 – Microbiome community structure between sample sites

图4 -样品位点间微生物群落结构

chao1是度量物种丰富度的指标，它和丰度、均匀度无关，但是它对稀有的物种很敏感

在认识Chao1指数前有两个概念需要理清：

singletons，即仅含有一条read的OTU，doubletons，即仅含有两条reads的OTU。

Shannon or Simpson’s alpha diversity indices

shannon指数 Shannon′s 多样性指数( H0 )

H0 = - ∑Xi ln ( Xi / n) ,

式中, X i 为位点i 在某一群体中出现的频率, n 为该群体检测到的位点总数

香农-威纳指数借用了信息论方法。信

息论的主要测量对象是系统的序（ order）或无序(disorder)的含量。

香农指数越大，生物多样性越高。香农指数来源于信息熵，香农指数越大，表示不确定性大。不确定性越大，表示这个群落中未知的因素越多，也就是多样性高。

辛普森多样性指数(Simpson index)该指数描述从一个群落种连续两次抽样所得到的个体数属于同一种的概率。

D值在0-1之间。0表示无限多样，1表示没有多样性。也就是说D值越大，多样性越低。这与直觉和逻辑不符，为了解决这个问题，通常会用1减去D：

此时，值越大多样性越高，这就变得更直观了

Beta-diversity analysis β多样性分析又称生境间的多样性（between-habitat diversity）

反映样本（组）间是否具有显著的微生物群落差异。

Beta多样性的分析仅仅就指是对样本间差异距离的分析

β = γ/α 

α多样性，β多样性和γ多样性。这三个概念都是由一位叫Whittaker的大人物最先提出的

非度量多维标定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling,NMDS)

一种适用于生态学研究的排序方法，主要是将多维空间的研究对象（样本或变量）简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法。

NMDS原设计的目的是为了克服以前排序方法中包括PCA、PCoA在内的缺点，即线性模型。NMDS的模型是非线性的，能更好地反映生态学数据的非线性结构

检验NMDS结果的优劣用胁迫系数（stress）来衡量，此值越小越好，当小于0.2是可以用NMDS的二维点图表示，当stress<0.05时具有很好的代表性：

使用R，ggplot2绘制NMDS图

Bonferroni correction，Bonferroni校正：如果在同一数据集上同时检验n个独立的假设，那么用于每一假设的统计显著水平，应为仅检验一个假设时的显著水平的1/n。

举个例子：如要在同一数据集上检验两个独立的假设，显著水平设为常见的0.05。此时用于检验该两个假设应使用更严格的0.025。即0.05* (1/2)。

该方法是由Carlo Emilio Bonferroni发展的，因此称Bonferroni校正。

对P值得界定，为了减少Type 1 错误的一种校正

生物信息数据分析

多样性指数

alpha多样性指数

   Chao1丰富度估计量（Chao1 richness estimator）

   香农-威纳指数（Shannon Wiener index）

   辛普森多样性指数（Simpson diversity index）

beta多样性指数

   PCoA分析

   PCA分析

   NMDS分析

PERMANOVA 置换多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA），又称非参数多因素方差分析（nonparametric multivariate analysis of variance）、或者ADONIS分析，其本质是基于F统计的方差分析，依据距离矩阵对总方差进行分解的非参数多元方差分析方法。

在生态统计中，可以使用PERMANOVA（往往同时配合排序分析来使用，对于PERMANOVA，更常与PCoA排序分析放一起说明问题），查看不同环境的群落组成结构差异是否显著。

Online Figure 2 – The effect of mode of delivery, gender and centre of recruitment on the upper (NPA) and lower airway (TAF) microbiome

在线图2——分娩方式、性别和招募中心对肺微生物学的影响

Online Figure 3. The effect of antibiotics on tracheal aspirate fluid (TAF) and nasopharyngeal aspirate (NPA) samples

在线图3。抗生素对气管吸出液( TAF )和鼻咽吸出液( NPA )样品的影响

prophylactic antibiotic regimen of benzylpenicillin and

gentamicin 青霉素和庆大霉素的预防性抗生素方案

Alpha diversity for NPA similarly similar between the antibiotic and no antibiotic samples

NPA的Alpha多样性在抗生素和无抗生素样品之间相似

Online Figure 4: Beta-diversity changes over time

在线图4：Beta-多样性随时间变化

Bray-Curtis Dissimilarity index Bray-Curtis 相异度（Bray-Curtis dissimilarity）是生态学中用来衡量不同样地物种组成差异的测度。

三角不等式会很难满足，因为它们并不是距离，而是一种dissimilarity

Bray-Curtis dissimilarity: 衡量样本之间的差异

0就是相同，1就是不同

非参数检验方法：Kruskal-Wallis 单因素 ANOVA（k 个样本）检验。

Kruskal-Wallis 检测是利用多个样 本的秩和来推断 各样本分别代表的 总体的位置有无差别，最后按所取检验 水准作出推断结论。

Figure 5 - Association of the lower airway microbiome with markers of inflammatory

图5下气道微生物学与炎性标志物的关联

interleukin-6 IL-6白介素-6; 介白素6; 白细胞介素6; 白细胞介素-6

白细胞介素6是一种细胞因子是免疫细胞作用于其它细胞所产生的蛋白质，有助于调节和促进免疫反应，也能刺激急性相关反应物产生，因炎症或是组织损伤时血液中浓度增加。

检测白细胞介素6有助于评价糖尿病、心血管病、炎症性疾病和感染性疾病

interleukin-8 IL-8 白细胞介素-8 又称为趋化因子CXCL8是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子。白细胞介素-8还有很强的促血管生成作用。白细胞介素-8在小支气管炎 和囊性纤维化 的发病中起重要作用。中性粒细胞与IL-8接触后发生形态变化，定向游走到反应部位并释放一系列活性产物；这些作用可导致机体局部的炎症反应，达到杀菌和细胞损伤的目的。

IL-6 and IL-8 were largely undetectable in the NPA and faecal fluid extracts

IL-6和IL-8在NPA和粪便液提取物中基本不可检测

bacterial load 细菌接种量; 细菌负荷; 菌载量???

Cytokines 细胞活素类 由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质

细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白。

具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。

细胞因子主要由白细胞合成，主要介导白细胞间的相互作用，于是将这些因子统一命名为白细胞介素(interleukin，IL)，并按发现的先后顺序冠以阿拉伯数字进行命名

Mean ± SEM 

SEM是standard error of mean是平均数的 抽样误差，反应平均数的抽样准确性。

SD全称standard deviation标准差，又常称均方 差，是离均差平方的算术平均数的平方根，用σ表示。

对于重复数少的小样本（n≤30）用mean ± S.E.M.，重复数多的大样本（n＞30）用 mean ± SD。

标准误是由样本的标准差除以样本容量的开平方来计算的。标准误更大的是受到样本容量的影响。

横断研究(cross-sectional study)是指在同一时间对不同年龄段的对象进行研究，而纵向研究(longitudinal study)是指在不同时间重复收集数据的研究。

Antimicrobials 抗菌剂; 抗微生物药物; 抗微生物剂; 抗菌药物

Azithromycin 阿奇霉素系15元环大环内酯类抗生素B

Anti-inflammatory 消炎; 抗炎

anti-infective 抗感染药

term-born infants足月儿

细菌群落结构中上、下气道与肠道存在差异，婴幼儿下气道出现单独的非生物性炎症过程，其发生CLD的风险增加。

尽管婴儿使用抗生素，但肺部炎性反应仍在发生，提示不易受常规抗生素如解脲支原体、支原体感染的微生物可能占主导地位，并可能成为降低早产儿CLD发生的治疗靶点