近几年，越来越多的临床专家看好液体活检在临床中的应用，而且液体活检在肿瘤早筛、肿瘤用药、疗效评估和复发监测方面的取得了重要进展。目前，液体活检样本多种多样，其中外周血中游离的核酸小片段DNA（cell-free DNA）和RNA（cell-free RNA），受到了极大的关注度，这些DNA或RNA源自正常细胞或肿瘤细胞的代谢与凋亡，具有极大的临床应用价值。已有研究报道cfRNA用于一些实体肿瘤，包括乳腺癌、结直肠癌、滤泡性淋巴瘤和肝细胞癌等的早期诊断。因此，cfRNA被认为是用于早期检测生物标志物的分析物来源。

今天跟大家分享一篇发表于cancers（IF=6.126）上的一篇利用cell-free RNA (cfRNA)测序检测早期肿瘤的文章Plasma Next Generation Sequencing and Droplet Digital-qPCR-Based Quantification of Circulating Cell-Free RNA for Noninvasive Early Detection of Cance

数据和方法

作者对11名非小细胞肺癌（NSCLC）患者、4名胰腺癌（PDAC）患者和4名健康供体进行cfRNA测序。随后，通过dd-qPCR对84例NSCLC（45例IV期，39例I-III期）、20例PDAC、12例恶性黑色素瘤（MM）、22例膀胱上皮癌（UBC）患者和61例健康供体进行了验证。此外，同样采用dd-qPCR方法对18例NSCLC和9例健康肺部癌旁组织的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本进行验证

研究结果

1.上皮细胞和单核细胞区分患者和健康的cfRNA

大多数实体瘤，包括肺腺癌，主要由上皮细胞发展而来。如果肿瘤对患者的cfRNA库有很大贡献，那么患者中由上皮细胞构成的转录信号在患者中应显著高于对照组。为了验证这一点，作者研究了不同类型的细胞对cfRNA库的贡献，以及特定类型细胞是否能将患者样本与健康样本区分开来。因此，作者基于吃饭RNA进行了细胞类型信号反褶积，其中包括来自45种不同的细胞类型。如图1所示，大多数细胞类型的信号贡献相似。然而，癌症患者中上皮细胞的贡献明显高于健康对照组(FDR = 0.04)。同样，健康人中的单核细胞贡献显著高于患者 (FDR = 0.02)。

2. cfRNA测序鉴定了癌症患者中共同上调的转录本

在初步的cfRNA测序研究中，来自PDAC和NSCLC患者的血浆cfRNA中有192个基因重叠上调(图2a,b)。非编码转录本显著促进了共同上调基因的表达，其中假基因、反义转录本和长非编码RNA分别占49.2%、19.2%和11.9%。蛋白编码基因仅占5.7%(图2c)。

此外，作者从GEO下载了NSCLC的基因表达数据，利用成对差异基因表达分析对肿瘤和健康对照组织进行差异分析，共筛选了3060个上调基因。随后通过与血浆中上调的基因取交集，共获得24个上调基因。其中lncRNA POU6F2-AS2和AC022126.1在肺癌的cfRNA和肿瘤组织中均上调，其中POU6F2-AS2之前报道的肺癌和食管鳞状细胞癌相关（图2 d-f)。因此，作者选择POU6F2-AS2和AC022126.1用于进一步的分析。

 3. lncRNAs POU6F2-AS2和AC022126.1在NSCLC癌患者血浆中表达上调

通过cfRNA-seq鉴定，POU6F2-AS2是一种癌症相关的转录物(图3A)。通过RT-ddPCR，在45例IV期NSCLC患者和39例I-III期NSCLC患者的血浆样本中确认POU6F2-AS2为肿瘤相关转录本(图3B)。POU6F2-AS2表达与NSCLC分期无相关性(图3C-D)。此外，POU6F2-AS2在非小细胞肺癌各期表达相似，不能区分早期和晚期疾病(AUC = 0.42)。相比之下，cfRNA 的lncRNA AC022126.1转录本不能区分癌症患者和健康供者(图3E-F)。

4. lncRNAs POU6F2-AS2和AC022126.1在NSCLC组织中上调

为了研究候选转录本在组织中的表达，作者使用公共数据库的RNA测序数据展示了POU6F2-AS2和AC022126.1在肿瘤中的表达，并从FFPE NSCLC肿瘤组织样本和癌旁组织中分离的RNA进行RT-ddPCR验证。在公开的肿瘤样本RNA测序数据中，与非肿瘤肺组织相比，肿瘤RNA中POU6F2-AS2转录水平显著上调(图4A,B)，且POU6F2-AS2的肿瘤表达与NSCLC分期无关(图4C)。通过对FFPE样本的RNA进行RT-ddPCR分析验证，发现肿瘤RNA中POU6F2-AS2的转录水平高于正常样本(图4D)。此外，在区分肿瘤和正常组织RNA方面，非小细胞肺癌分期不受影响(图4E,F)。

5. POU6F2-AS2在其他癌症中表达上调

接下来作者研究了POU6F2-AS2转录本是否只在NSCLC血浆中上调。为此，作者分析了从另外20个PDAC、22个UBC和22个健康血清样本中分离的cfRNA。此外，还分析了从12 MM血浆样本中分离的cfRNA。研究发现，在来自PDAC血清的cfRNA中，患者中POU6F2-AS转录水平显著高于健康对照组(图5A，B)。在恶性黑色素瘤中，患者中血浆的POU6F2-AS2转录水平显著高于对照组(图5C)。UBC样本相比健康组无明显差异（图5D）。

总结

总之，文章的整体思路比较清晰，作者并不旨在评估cfRNA在疾病监测和治疗监测中的作用，但它确实证明cfRNA在实体肿瘤，特别是NSCLC的早期诊断中的作用。最重要的是，所选候选对象的跨实体验证和肿瘤组织关联增强了数据的可信度，并为生物标志物的发现带来了新的机会。

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