生信论文新套路

1. 差异分析 (differential expression)；
2. 生存分析 (survial analysis)；
3. 相关分析 (correlation analysis)；
4. 组学分析 (genomic alterations)；
5. 突变分析 (mutational analysis)；
6. 免疫分析 (tumor infiltration analysis)。

免疫浸润是一整套知识体系，是一种逻辑思维的方式，一旦拥有这种崭新的角度，作为医生，我们将能从更深刻地维度去认识肿瘤，去诊治病人。我们有幸读到一篇免疫浸润的综述，内容系统，思路条理，逻辑层层递进，非常值得果友们学习；更幸运的是，果友们积极参与综述翻译，并顺利完成任务。感谢果友们的支持和参与。这篇论文是多位果友参与完成，愿果友们反复阅读，仔细推敲琢磨，留言讨论，或查阅参考文献。

致谢

感谢果友们积极参与翻译该免疫浸润主题的综述。感谢每一位参与者（昵称）的贡献。

根据综述主要内容，我们将综述分为上篇——免疫治疗和下篇——免疫浸润。对于从事肿瘤临床诊治和研究的医生来说，尽管这篇综述对于肿瘤免疫的基础知识涉及不多，但是高屋建瓴地提供认识肿瘤免疫的路径。肿瘤免疫基础知识我们会通过PPT（免费）和视频（收费）形式在公众号分享。请果友们多多关注。

该综述下篇主要是肿瘤微环境中免疫细胞浸润的总结，是我们关注的核心。

肿瘤浸润免疫细胞及其与免疫治疗的关系

肿瘤免疫治疗，如细胞过继转移和肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的成功，已经证明免疫细胞，特别是T细胞，可以用来消除肿瘤细胞。尽管免疫治疗有持续的临床疗效，但只有一小部分肿瘤患者从中受益。⁹³ 作为肿瘤微环境的主要组成部分，免疫浸润已被证实有助于肿瘤进展和免疫治疗反应。⁹⁴ 因此，更好地理解肿瘤微环境中的固有免疫细胞和适应性免疫细胞对于破译免疫治疗机制、定义预测性生物标志物和识别新的治疗靶点至关重要。

注：无论是基础研究还是生信分析，免疫浸润细胞一般包括6种细胞，T细胞、B细胞、NK细胞（俗称TBNK），树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞（统称髓系细胞）。

T细胞

因具有强效的肿瘤杀伤能力，T细胞成为肿瘤免疫的焦点^95，96。T细胞通过主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）分子或人类白细胞抗原呈递的肿瘤抗原短肽与T细胞受体（TCR）反应而发挥作用。T细胞受体由大量TCR基因片段随机重组的基因重排产生，其过程可能产生各种T细胞受体组成成分，赋予T细胞多样性和特异性^97，98。肿瘤浸润淋巴细胞在有效抗肿瘤免疫中起关键作用，并且不同类型T细胞，包括细胞毒性T细胞（CTL），辅助性T细胞（T_H）和调节性T细胞（Tregs），均参与肿瘤微环境内T细胞介导的免疫反应⁹⁹。 

细胞毒性T细胞是关键的效应细胞，可与细胞毒性分子，如颗粒酶和穿孔素，一起发挥功能¹⁰⁰。研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞，特别是细胞毒性T细胞的存在，与多种癌症患者存活呈正相关^101，102。但是，由于肿瘤微环境的免疫抑制导致其耗竭或功能失调，肿瘤部位浸润的细胞毒性T细胞往往不能控制肿瘤生长^94，103-105。T细胞耗竭的特征是PD-1和其它抑制分子上调，最初在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠模型中报道，并证明在人类癌症中普遍存在^106，107。例如，Thommen等对非小细胞肺癌（NSCLC）患者中PD-1表达水平不同的三群瘤内CD8⁺ 肿瘤浸润淋巴细胞亚群的特性进行分析，发现PD-1高表达的肿瘤浸润淋巴细胞已耗竭，但可预测非小细胞肺癌患者对PD-1抗体治疗的反应¹⁰⁸。这些发现及免疫检查点抑制剂深入人心的临床疗效突显了干预T细胞功能异常在肿瘤治疗中的重要性^109-111。

CD4 T细胞包含辅助性细胞和调节性T细胞。辅助性T细胞通过帮助CD8效应T细胞¹¹²或通过充当细胞毒性T细胞来直接消除肿瘤细胞而有助于抗肿瘤免疫^113，114。与此相反，调节性T细胞对于维持稳态必不可少¹¹⁵，通过可溶性免疫抑制因子直接破坏T细胞功能，以及CTLA-4介导的抑制抗原呈递细胞共刺激信号间接阻止T细胞活化，从而协调抗肿瘤免疫^116，117。值得注意的是，抗CTLA-4抗体不仅可以阻断负调节信号通路来加强T细胞反应，也可诱导Treg耗尽^118，119，表明免疫检查点抑制剂在抗肿瘤免疫中作用机制复杂。

B细胞

B细胞是在适应性免疫系统体液免疫中起作用的体液免疫细胞。在被感染细胞或肿瘤细胞的刺激下，B细胞分化为记忆B细胞或浆细胞，后者可分泌免疫球蛋白（Igs，也称为抗体）以结合并中和靶抗原¹²⁰。值得注意的是，B细胞激活涉及抗原与B细胞受体（BCR）相互作用。BCR是膜结合形式的Ig（mIg），赋予B细胞抗原特异性。每个B细胞都具有独特的BCR，该BCR源自Ig基因片段随机重排产生的高度多样化的BCR基因库¹²⁰。BCR基因库具有不同的抗原特异性，当遇到抗原时，可以通过生发中心的类型转换重组和体细胞超突变进一步修饰所选择的BCR，从而获得针对靶抗原的最佳抗体^121，122。

B细胞不仅通过产生的抗体在体液免疫中起着至关重要的作用，而且还通过充当抗原呈递细来增强T细胞介导的免疫反应，或通过细胞因子或调节性B细胞调节免疫应答，参与细胞免疫^123，124。此外，B细胞在慢性炎症和肿瘤部位辅助维持二级淋巴器官结构和促进三级淋巴结构（TLSs）形成。三级淋巴结构是免疫细胞，如T细胞、B细胞和滤泡树突状细胞聚集的高级有序结构¹²⁵。三级淋巴结构对于B细胞和T细胞募集和局部激活特别重要，因此有助于长期免疫^125，126。

由于在体液和细胞免疫中的多功能性， B细胞在抗肿瘤免疫中表现出表型多样性。¹²⁷研究表明，肿瘤浸润B细胞（Tumor-infiltrating B cells，TIB）通过分泌可溶性因子促进髓样细胞促血管生成和促肿瘤功能，或通过产生促进肿瘤细胞信号转导的因子来抑制T细胞介导的免疫反应，从而促进肿瘤进展^128-130。然而，与促肿瘤作用相反的是，越来越多研究表明B细胞具有抗肿瘤免疫功能，并可能有利于患者预后。研究证明，CD20⁺ 肿瘤浸润B细胞与非小细胞肺癌和卵巢癌患者的预后良好相关，机制可能是充当抗原呈递细胞来增强细胞毒性T细胞反应^131，132。值得注意的是，Cabrita等发现，三级淋巴结构形成以及肿瘤中CD20⁺ B细胞和CD8⁺ T细胞同时存在与转移性黑色素瘤患者的生存期改善有关，并可预测免疫检查点抑制剂的临床效果¹³³。与这些观察一致的是，B细胞与免疫治疗反应有关。Hollern等在高突变负荷的三阴性乳腺癌小鼠模型中发现，免疫检查点抑制剂可诱导滤泡辅助性T细胞和B细胞的活化，而活化的B细胞通过分泌抗体和呈递抗原激活T细胞来促进抗肿瘤反应¹³⁴。与小鼠研究的这些发现相一致，临床研究也强调B细胞与三级淋巴结构在肿瘤免疫治疗中的重要性。例如，Jahrsdörfer等发现B细胞可产生颗粒酶B，并可在B-CLL中基于IL-2活化而获得细胞毒性¹³⁵。此外，Petitprez等发现，包含B细胞和其他免疫细胞的三级淋巴结构为特征的软组织肉瘤亚型患者，其生存率改善，PD-1阻断剂反应率较高¹³⁶。同时，Helmink等发现，在对免疫检查点抑制剂治疗有反应的转移性黑色素瘤和转移性肾细胞癌（RCC）患者肿瘤的三级淋巴结构中，CD20⁺ B细胞与T细胞存在共定位¹²⁵。此外，他们进一步鉴定到有反应患者中存在明显的克隆扩增和BCR多样性，为深入了解B细胞和三级淋巴结构在肿瘤免疫治疗的关键作用提供视角。

因此，尽管还需要进一步研究以阐明B细胞介导反应在免疫治疗中的机制，这些发现已指出B细胞在抗肿瘤免疫调节中的关键作用，并表明B细胞和三级淋巴结构在肿瘤治疗的重要应用。

NK细胞 （自然杀伤细胞）

NK细胞是能发挥细胞毒作用而无MHC特异性的典型固有淋巴样细胞，因此能与细胞毒性T细胞所介导的MHC限制性肿瘤溶解相辅相成。^137,138NK细胞可通过溶细胞颗粒直接清除肿瘤细胞，还可通过促炎细胞因子和趋化因子协同其他免疫细胞起作用。^138–140重要的是，NK细胞的活化是由其表面的激活或抑制性受体共同介导的。抑制性受体能与正常细胞上的MHC I类分子相互作用，使NK细胞产生自身耐受。而激活性受体则感知细胞应激（病毒感染或病毒感染细胞发生肿瘤增生，及或肿瘤细胞MHC I类分子表达缺失）的信号，从而引起NK细胞的活化和效应作用。¹³⁹越来越多研究表明，在肿瘤微环境中，NK细胞的功能会因细胞毒效应减弱和促炎性因子的表达改变而受到阻碍。¹³⁹Böttcher等发现肿瘤中的NK细胞能在肿瘤微环境中募集cDC1 细胞，并促进抗肿瘤免疫，而肿瘤细胞能产生前列腺素E2损害NK细胞的功能，引起免疫逃逸。¹⁴⁰因此，NK细胞也可作为潜在的靶点。

现已探索出几个基于NK细胞的免疫治疗, 包括过继转移自体抑制NK细胞，也就是把从活体中提取的活化NK 细胞和，经体外扩增后输注到患者体内。¹⁴¹还有CAR-NK细胞治疗，也就是输注改造过的NK细胞，这类NK细胞能表达抗特定肿瘤抗原CARs。¹⁴²还有细胞因子治疗，也就是输注增强NK细胞活性的特定细胞因子。¹⁴³最后，还有基于mAbs的治疗，指输注抗体以阻断NK细胞上的抑制性受体。¹⁴⁴

跟阻断T细胞上抑制性通路的免疫检查点抑制剂相似，阻断NK细胞上的抑制性受体同样颇有前景。几种NK细胞抑制性受体的治疗潜力和临床应用已经在探索阶段。^145–147杀伤免疫球蛋白受体家族（KIR）和CD94/NKG2A异质二聚体是人类NK细胞上主要的抑制性受体。¹⁴⁵单独应用抗KIR抗体或联合其他治疗药物能提高NK细胞的抗肿瘤效应。¹⁴⁶另外，抗NKG2A抗体在触发NK细胞反应方面同样有效。¹⁴⁷还有Monalizumab，一种新型抗NKG2A抗体，目前正处在检验抗肿瘤效能的临床试验阶段。需要着重说明的是，除了抑制受体，激活受体也能被利用, 如用细胞因子上调它们的表达，或传递覆盖目标细胞的抗体来激发NK细胞毒性。¹⁴⁵举个应用该方法颇有成效的例子，Andrade 等设计了可避免人肿瘤细胞丢失细胞表面MICA和MICB的抗体，MICA和MICB都是应激诱导分子，能被NK细胞上NKG2D的激活受体识别。他们还发现，这些抗体通过增强NK细胞介导的抗肿瘤免疫抑制肿瘤生长。¹⁴⁴综合考虑，将NK细胞应用于治疗中有很好的前景，值得进一步探索。

骨髓细胞

髓系细胞包含异质的细胞亚群，有粒细胞和单核巨噬细胞，^148–150它们也被证明在肿瘤免疫中扮演关键的作用。¹⁴⁹

粒细胞中最常见的亚型是中性粒细胞，其典型功能是在固有免疫中抵抗细菌和真菌感染，但其在肿瘤免疫中的角色尚具争议。¹⁵¹Szczerba等发现，中性粒细胞辅助血流中循环肿瘤细胞，有促进其转移的潜能。¹⁵²而Ponzetta等则发现中性粒细胞在一种固有样表型非常规T细胞的极化中起关键作用，因此有助于抗肿瘤免疫。¹⁵³另外，Fridlender等发现中性粒细胞在肿瘤微环境中有不同的激活状态，N1表型起抗肿瘤生成作用，而N2起促肿瘤生成作用。¹⁵⁴这些发现强调肿瘤相关中性粒细胞作用的多样性，因此有必要做更深入的研究，全面剖析人类肿瘤中的肿瘤相关中性粒细胞，而这有可能开启通过调节中性粒细胞作为肿瘤治疗的新模式。

单核吞噬细胞，由单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞组成，通过感知病原体和吞噬作用在固有免疫中起作用，¹⁴⁸并作为相互作用的细胞成分在适应性免疫中将抗原提呈给T细胞。¹⁴⁸树突状细胞是主要的抗原呈递细胞，现已确认树突状细胞主要有两种亚型，即类浆细胞树突状细胞（pDCs）和传统树突状细胞（cDCs）。¹⁵⁵pDCs能产生高水平 I型干扰素并在调节固有和适应性免疫中起重要作用。¹⁵⁶虽然pDCs最初被认为在抗病毒免疫中起作用，但近期研究者对其在肿瘤发生方面起的作用产生了兴趣。研究表明，pDCs的次级产物，尤其是I型干扰素，在肿瘤免疫中同时有免疫原性和致耐受性作用。^157,158这些因子通过提高NK细胞和T细胞的细胞毒性，辅助激活B细胞向浆细胞分化，促进树突状细胞和促炎症反应性巨噬细胞的成熟和活化，最终共同促成一个免疫活化的肿瘤微环境。^52,159,160它们同时通过募集Treg细胞或诱导免疫调节分子（如参与负调控途径的免疫调节分子）的表达，营造免疫抑制肿瘤微环境。^158,160,161另外，pDCs能作为专业的抗原呈递细胞调节抗肿瘤免疫反应。¹⁵⁷因此，pDCs在肿瘤免疫中的多样化角色尚未明晰。cDCs包含两种亚型：cDC1s和cDC2s，它们有着不同的表型，功能和转录因子依赖。¹⁶²cDC1s专门将MHC I上的抗原提呈给CD8 T细胞。而cDC2s将MHC II上的抗原提呈给CD4 T细胞。¹⁶³cDC1s通过肿瘤微环境里的局部效应和向肿瘤引流淋巴结(dLNs)的抗原呈递促成抗肿瘤免疫。具体来说，肿瘤微环境中的cDC1s分泌如CXCL9和CXCL10的趋化因子以协助效应T细胞和NK细胞向肿瘤聚集，还产生细胞因子帮助维持效应细胞的细胞毒性作用。¹⁶⁴另外，cDC1s能迁移到引流淋巴结，将肿瘤抗原多肽提呈给初始型CD8 T细胞，引起抗原特异性免疫反应的活化和启动。¹⁶⁵cDC2s是最常见且异质性最高的DC亚型，它们促进大量CD4 T细胞介导的免疫反应。^166–168虽然cDC2s被认为主要通过激活T细胞来起作用，但其在抗肿瘤免疫中的具体作用尚未明确。研究者对解析cDC2s在肿瘤微环境中的异质性和功能的兴趣与日俱增。

巨噬细胞是一类吞噬细胞，包括一群在肿瘤微环境中有复杂表型和特性作用的异质性细胞群。巨噬细胞能通过吞噬作用或通过产生可溶性因子诱导肿瘤细胞凋亡从而清除恶性细胞。¹⁶⁹除了直接的肿瘤杀伤能力，巨噬细胞还通过血管新生，纤维化和免疫监测等机制，在调节肿瘤进展中起重要作用，巨噬细胞可通过分泌不同分子动员或中和血管内皮生长因子来发挥促血管生成和抗血管生成作用，从而调节肿瘤微环境中的血管生成。¹⁷⁰同时，巨噬细胞是肿瘤相关纤维化的关键协调者，它通过不同的介质来促进或抑制细胞外基质堆积，从而改变邻近的成纤维细胞，^171,172诱导形成的纤维化能调节T细胞的渗透和活化。此外，巨噬细胞能产生干扰素IL-12和表达包括CD86在内的共刺激分子，引起细胞相互作用，从而介导T细胞活化。相反，巨噬细胞也能通过表达T细胞抑制分子，分泌免疫抑制性因子或促进免疫抑制性Tregs募集这三种方式介导T细胞的抑制。⁷²因此，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肿瘤微环境中有显著的作用，并可能带来肿瘤免疫治疗的新机遇。

单细胞水平研究肿瘤免疫浸润细胞的新技术

作为适应性免疫的关键组成部分，T细胞由于其对抗原识别的特异性和强大的肿瘤杀伤力而成为免疫治疗的核心。⁹⁶肿瘤浸润淋巴细胞是由具有复杂功能状态（如幼稚，效应因子，记忆和功能障碍）的不同亚群组成的异质细胞群（如CD8 +，CD4 + TH1，TH2，TH17和Treg细胞）。¹⁰¹另外，这些T细胞亚群表现出对组织分布的偏好^173,174 和表肿瘤微环境中的跨组织迁移和状态转变的动态特性。¹⁷⁴

由于这种异质性，常规方法无法解析各种T细胞亚群的特征。随着单细胞技术的发展，单细胞分析下大量肿瘤浸润免疫细胞的特点引起肿瘤免疫学家的极大兴趣。最近，新型单细胞方法，包括质谱流式细胞术和单细胞测序（scRNA-seq），已呈现出发展势头，并促进对肿瘤相关T细胞和其他免疫细胞特点的了解（图2和 图3）。

单细胞蛋白质分析是了解肿瘤浸润淋巴细胞表型异质性的重要方法。质谱流式细胞术（CyTOF）利用金属同位素标记的抗体与微调质谱检测相结合，能够以低成本量化数百万个细胞中的40多种蛋白质。¹⁷⁵相比之下，单细胞测序包括plate-based 和droplet-based两种技术方法²⁷ (图2a)，可以同时量化成千上万个转录本。因此，它能够揭示稀有细胞群，揭示复杂的调控机制，并跟踪发育过程。近来，这两种方法已用于评估各种类型肿瘤的肿瘤生态系统(图2), 因为蛋白组和转录组都可以提供对肿瘤微环境中免疫浸润功能特征的重要认识。

通过单细胞技术捕获T细胞状态

单细胞研究描绘不同类型肿瘤组织如皮肤，肺，肾，乳腺，结肠和头颅的T细胞特征，包括组成、功能状态以及病灶的动态变化^27,176 (图2b)。这些研究使我们对肿瘤免疫浸润有了一定了解，为探究免疫逃逸的机制和开发进一步增强抗肿瘤免疫力的新策略提供机遇。

高肿瘤突变负荷（TMB）¹⁷⁷ 黑色素瘤，由于其对免疫检查点抑制剂治疗具有高反应率，因此处于肿瘤免疫学研究的前沿。¹⁷⁸ Tirosh等应用scRNA-seq方法研究转移性黑色素瘤的多细胞生态系统，并分析恶性细胞和非恶性细胞的表型多样性。¹⁰⁴ 尽管受细胞数量的限制，但该研究通过T细胞分析再现肿瘤浸润淋巴细胞的衰竭表型。同样，Li等发现功能失调的肿瘤浸润淋巴细胞是高度增殖，动态分化的单克隆细胞群，在黑素瘤的肿瘤微环境中表现出连续的分化图谱。¹⁷⁹这样的研究为我们提供了解TME肿瘤微环境中T细胞特征的机会，并扩展我们对人类黑素瘤T细胞功能衰竭的认识。

肺癌具有广泛的基因组改变，并且对检查点阻断治疗有更好的应答。^80,177 因此，肺癌通常是肿瘤免疫治疗的研究目标。Lambrechts等提出肺癌中肿瘤生态系统的单细胞转录组学目录。然而，尽管有大量免疫细胞，但他们强调基质细胞的表型构建及其对免疫细胞的调节，从而与免疫治疗建立间接联系。¹⁸⁰相反，Lavin等利用质谱流式细胞术绘制与早期肺癌相关的免疫细胞图谱。¹⁷³ 他们通过在肿瘤病灶处观察到CD8效应T细胞显著减少，伴随着Tregs细胞扩增和T细胞耗竭，发现免疫抑制性微环境。类似地，GUO等应用scRNA-seq技术描绘非小细胞肺癌中T细胞的转录组学情况。¹⁸¹他们描绘肿瘤浸润淋巴细胞的变化轨迹，并确定两簇将耗竭CD8 T细胞的功能状态，这两种细胞均与良好预后相关。这些发现为肺癌T细胞的功能状态和动力学提供更深入的见解，这将有助于肿瘤治疗和患者分层。

肾细胞癌（RCC）是成人中最常见的肾脏肿瘤，尽管与黑色素瘤或非小细胞肺癌相比其肿瘤突变负荷较低，¹⁷⁷但是其插入和缺失突变率却很高。¹⁸² 肾细胞癌患者的亚型可受益于免疫检查点抑制剂治疗，而纳武单抗（nivolumab）是一种已被批准用于治疗转移性肾细胞癌的抗PD-1抗体。²¹ Young等构建健康人和肿瘤患者肾脏的单细胞转录组数据，并鉴定肾肿瘤细胞及其组成。¹⁸³尽管他们同时鉴定免疫细胞和非免疫细胞，并重点关注非免疫细胞部分，但其提供的肾细胞癌中免疫细胞功能的信息仍然有限。相比之下，Chevrier等提出基于质谱流式细胞术的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）（最常见的肾细胞癌类型）中免疫浸润的单细胞图谱，并揭示肿瘤微环境中免疫细胞的表型复杂性。¹⁸⁴ 透明细胞肾细胞癌中T细胞的免疫抑制表型，包括功能耗竭T细胞和抑制性Tregs细胞。这些发现扩展了我们对T细胞表型多样性的看法，并为肾细胞癌的免疫治疗提供候选靶点。

结直肠癌（CRC）对免疫肿瘤学家的吸引力很大，因为其肿瘤浸润免疫细胞比组织病理学方法更能预测结直肠癌患者的存活率。⁹⁵此外，免疫检查点抑制剂对患有微卫星不稳定性（MSI）的结直肠癌患者有效，但对微卫星稳定的患者无效，¹⁸⁵ 其分子机制尚不明确。Li等学者使用scRNA-seq技术进行结直肠癌肿瘤生态系统的转录组分析。¹⁸⁶由于该研究专注于聚类算法开发，因此该研究提供的生物学见解有限，尤其是对于结直肠癌中的免疫细胞功能。值得注意的是Zhang等通过RNA测序和TCR追踪（STARTRAC）法整合单T细胞分析，对结直肠癌中的T细胞进行综合分析。¹⁷⁴

他们阐述具有不同功能和不同克隆的T细胞亚群动态关系。此外，他们发现Th1样亚型主要表达微卫星不稳定性患者中，这阐释其对免疫检查点抑制剂反应良好的潜在细胞机制。这些发现加深我们对CRC中T细胞特征的了解，并加速了免疫检查点抑制剂治疗机制的研究。

由于免疫学上的“冷结节”表型，¹⁸⁷乳腺癌（BC）历来被认为难以进行免疫治疗，但最近研究表明，免疫检查点抑制剂具有改善乳腺癌患者亚型结局的潜力。²³ 单细胞研究提供对肿瘤生态系统的了解，包括乳腺癌中的免疫细胞多样性。Chung等在原发性乳腺癌中进行单细胞转录组分析。¹⁸⁸尽管受细胞数量的限制，但这项研究发现，在乳腺癌肿瘤微环境中肿瘤内存在异质性并观察到T细胞显示出的免疫抑制特性。同样，Savas等揭示乳腺癌中T细胞亚群的细胞异质性，并发现有助于乳腺癌免疫监视的组织驻留记忆T细胞亚群表达高水平免疫检查点分子和效应蛋白。¹⁸⁹尽管此类分析为乳腺癌肿瘤学中的T细胞功能提供重要线索，但是在乳腺癌中肿瘤浸润淋巴细胞的表型可塑性和动态变化仍需进一步探索。重要的是，Azizi等提供人类乳腺癌中免疫细胞的大规模单细胞转录图。¹⁹⁰他们发现，T细胞簇具有多种不同的环境特征，肿瘤驻留T细胞被定位在连续的活化和分化轨迹上，组合的环境刺激和TCR利用塑造肿瘤浸润淋巴细胞的多种表型。这项研究为乳腺癌中肿瘤浸润免疫细胞的表型多样性提供更为细致入微的观点，这可能有助于更好地了解肿瘤进展和治疗反应的机制。尽管涉及不同的乳腺癌亚型，但该研究受患者人数的限制，无法提供足够的信息来评估乳腺癌各类亚型中免疫细胞表型的区别。相反，Wagner等破译具有乳腺癌亚型的患者的肿瘤和免疫细胞的单细胞蛋白质组学，从而了解不同乳腺癌亚型之间的生态系统差异，尤其是免疫细胞的差异。¹⁹¹ 值得注意的是，他们在高级别雌激素受体阴性（ER-）和ER阳性（ER+）肿瘤中观察到较高水平的Tregs细胞和耗竭T细胞，可能表明ER-和ER+患者有对免疫检查点抑制剂更好反应的细胞基础。在乳腺癌生态系统中的此类肿瘤免疫关系，可以帮助指导患者分层并促进个性化免疫治疗。其他具有肿瘤微环境单细胞特点的肿瘤包括头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和肝细胞癌（HCC）。Puram等通过scRNA-seq技术研究了头颈部鳞状细胞癌中的原发性和转移性肿瘤生态系统。¹⁹²他们鉴定头颈部鳞状细胞癌中不同的T细胞亚群，并确定T细胞功能衰竭程序，然而，由于关注点主要集中于非免疫部分，他们提供的关于T细胞功能的信息则是有限的。Zheng等绘制肝癌单细胞T细胞的转录图谱，并通过观察肿瘤中浸润的Tregs细胞和CD8 T细胞的克隆富集，发现肿瘤内T细胞的免疫抑制表型。这项研究首次对肿瘤浸润淋巴细胞进行大规模和深入分析，揭示HCC进展的潜在细胞机制。¹⁰⁵

综合来说，这些基线数据分析共同阐明多种肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞的基本特性。不同肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞在抗肿瘤免疫方面表现出共同和特定的特点¹⁷⁴，这可能是由不同器官的特殊组织微环境驱动的。因此，对更多肿瘤患者进行T细胞特征的全面分析将阐明肿瘤进展的机制和治疗应答的差异，从而促进肿瘤治疗中的个性化免疫治疗。

尽管细胞组成和功能状态是肿瘤浸润淋巴细胞的主要特点，但其抗原特异性也可作为抗肿瘤免疫应答的关键决定因素，并可影响免疫治疗的有效性。越来越多证据表明，肿瘤中相当一部分T细胞与癌旁正常组织有共同的TCR（T细胞受体），这表明它们可能与抗肿瘤免疫无关。此类T细胞代表靶向突变背景或病毒感染的“旁观者”T细胞，^193–195 或者它们可能反映由肿瘤内炎症反应驱动的效应或记忆T细胞从血液向组织的连续迁移。^174,196重要的是，临床上有效的肿瘤浸润淋巴细胞是靶向肿瘤抗原T细胞；¹⁹⁷因此，分离肿瘤反应性T细胞对基于T细胞的免疫治疗至关重要。实际上，目前已经建立用于确定、分离和扩增T细胞特异性抗原的创新策略。Simoni等证明特异性标记物如CD39可用于鉴定肿瘤反应性T细胞。¹⁹⁵ Tran等将肿瘤浸润淋巴细胞与自体树突状细胞共培养，并体外转染编码自体肿瘤突变基因短肽的串联基因mRNA，以分离与肿瘤特异性抗原反应的T细胞。¹¹³ 此外，Dijkstra等利用自体肿瘤类器官与PBLs（外周血B淋巴细胞)的共培养来从外周血中富集肿瘤反应性T细胞。¹⁹⁸ 这种方法为临床应用提供分离肿瘤反应性T细胞的有效手段。

虽然上述未经治疗肿瘤的基线概况分析提供了肿瘤浸润淋巴细胞在多种肿瘤中的固有特性，但关于治疗或干预研究可更好地了解免疫治疗分子基础和开发预测临床疗效的新方法。Jerby-Arnon等应用scRNA-seq技术研究免疫检查点抑制剂治疗前后人黑素瘤中的肿瘤细胞状态。¹⁹⁹他们发现恶性肿瘤细胞可以表达与T细胞排斥和免疫逃逸相关的耐药性程序，结合免疫治疗可抑制肿瘤的生长。这些发现提出攻克免疫检查点抑制剂耐药的新策略。然而，与肿瘤细胞的分子变化相比，人们更多关注免疫检查点抑制剂治疗中肿瘤浸润淋巴细胞的表型和功能动力学。通过对接受免疫检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者单个免疫细胞进行分析，²⁰⁰ Sade-Feldman等发现CD8 T细胞表达TCF7蛋白或功能失调的两种独特状态可以预测免疫检查点治疗的成功或失败，从而突显肿瘤微环境中异种T细胞亚型的临床意义。同样，Yost等对抗PD-1抑制剂治疗的基底或鳞状细胞癌患者T细胞进行成对单细胞RNA和TCR测序，并揭示PD-1阻断后肿瘤特异性T细胞的克隆替代。²⁰¹具体来说，他们发现免疫检查点抑制剂处理可诱导T细胞的克隆扩增，而克隆扩增并非源自先前存在的肿瘤浸润淋巴细胞，而是由新克隆型组成。这些结果强调全身免疫反应的重要性及募集外周T细胞对免疫检查点抑制剂治疗有效的必要性。

外周血中T细胞可以迁移并浸润到肿瘤中，以补充效应池。因此，在免疫检查点抑制剂治疗前和后人外周血单个核细胞的变化也得到深入研究。Wu等对不同肿瘤患者T细胞RNA和TCR进行单细胞测序，他们发现在肿瘤组织、邻近正常组织和外周血整个系统水平上，类效应器T细胞的克隆性扩增可以介导更好地抗PD-L1治疗反应。²⁰² 这些发现表明，对免疫检查点抑制剂有效应答需要外周血中补充新鲜的、未耗竭的T细胞。同样，Krieg等使用质谱流式细胞术鉴定转移性黑色素瘤患者抗PD-1免疫治疗之前和之后外周血中的免疫细胞亚群。²⁰³ 他们发现，在应答者中，当肿瘤中CD8 T细胞增加时外周血中的T细胞则是减少的，这表明免疫检查点抑制剂应答和系统免疫具有重要性的主要原因是CD8 T细胞具有更高的迁移能力。值得注意的是，他们发现髓样细胞的突变频率还可以预测抗PD-1治疗反应性，从而强调髓样细胞在抗肿瘤免疫应答及其潜在临床应用中的重要性。

尽管T细胞已是肿瘤免疫治疗的重要靶点，人们希望采用单细胞技术探索髓样细胞的异质性。近年来，髓样细胞也受到关注，因为髓样细胞在肿瘤微环境中表现出特定的表型和功能，这些表型、功能通过调节T细胞功能、直接调节肿瘤细胞的生长，进而影响肿瘤进展和免疫治疗的反应 （图3）。

作为专职抗原呈递细胞，树突状细胞不仅在T细胞活化中起着核心作用，并且是维持长期抗肿瘤适应性免疫反应的必要条件。从不同树突状细胞亚群的表型和功能来看，虽然pDCs和cDC1在抗肿瘤免疫中的作用可能还需要进一步验证，但是由于二者构成相对同质，目前它们的功能较为清楚。相比之下，cDC2s由异质组分构成，因此其功能尚不清楚。单细胞技术使人们不论在健康和疾病状态下都可以全面探知树突状细胞组分。例如，Villani等使用scRNA-seq在人血液的cDC2s亚群中确定一个新的分支表型。²⁰⁴同样，Ductertre等在风湿性疾病活动性相关的循环炎性树突状细胞和生物标记物的基础上, 从功能上揭示cDC2s中独特的亚群。²⁰⁵关于肿瘤中树突状细胞亚群，Brown等发现以不同发育途径和转录调控因子为特征的两种主要cDC2s谱系，二者在小鼠和人类黑色素瘤中表现出明显的促炎和抗炎潜能。¹⁶⁷Zhang等报道称，表达LAMP3的cDCs子细胞亚群可从肝肿瘤转移到肝淋巴结并调节淋巴细胞的活化。²⁰⁶这些发现强调树突状细胞亚群的异质性，并促进树突状细胞特定亚群相关靶向免疫治疗的发展。 

图2.不同类型肿瘤单细胞分析策略和单细胞研究。a.单细胞技术工作流程，包括单细胞测序和流式细胞术。对于单细胞测序，深度分析或大规模分析基于平板和液滴的常用策略。b.基于目前单细胞技术分离各种组织类型肿瘤免疫浸润的研究总结。（注：Tech技术；FACS荧光激活细胞分选；T肿瘤；N邻近正常或健康组织；P外周血；其他细胞、非免疫细胞（包括恶性细胞和间质细胞）；scTCR单细胞TCR信息；BCC基底细胞癌；SCC鳞状细胞癌；NSCLC非小细胞肺癌；RCC肾癌；ccRCC肾透明细胞癌；CRC大肠癌；BC乳腺癌；HCC肝细胞；HNSCC头颈部鳞状细胞癌；Endo AD子宫内膜腺癌。）

图3. 肿瘤微环境中免疫细胞的功能特性及动态变化。在肿瘤微环境中，外周血T细胞可能受微环境中免疫抑制的驱动，转换功能状态。诱导初始效应T细胞或辅助T细胞不断分化并最终衰竭，使原本静息状态下的自然调节性T细胞活化而抑制免疫反应。^179,181这种状态会导致效应T细胞减少，而耗竭性T细胞和抑制性T细胞不断聚集，这两种细胞都被证明在肿瘤微环境中增殖和高度克隆性扩张。^174,179血液中的髓样细胞主要是单核细胞，包括CD14+和CD16+亚群，而这些细胞在肿瘤中倾向于分化为巨噬细胞和树突状细胞。^173,206而肿瘤微环境会将其塑造成免疫抑制表型，使抑制性巨噬细胞肿瘤相关单核细胞和树突状细胞cDC2s增多，而具有免疫活性的CD16+巨噬细胞和cDC1s树突状细胞减少。^173,184此外，单细胞测序有助于识别肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的新亚群，并揭示巨噬细胞亚型趋向于共同表达M1和M2信号，因此与极化模型不一致。^167,190,191 当NK细胞被激活和抑制受体的综合信号激活时，可以通过穿孔素和颗粒酶发挥细胞毒性功能，^138–140然而，在肿瘤微环境中，它们显示出细胞数量减少，细胞毒性功能受损，免疫反应协调作用受阻，如cDC1招募受阻。^140，173肿瘤细胞可能通过分泌免疫抑制因子和表达抑制性受体配体来驱动NK细胞的功能缺陷，同时减少激活受体配体表达来阻碍NK细胞活化。^139,140,173 B细胞在抗肿瘤免疫和ICI治疗中发挥着重要作用，由聚集的T细胞、B细胞和FDC组成的 三级淋巴结构，可介导对免疫检查点抑制剂反应的改善，其机制可能与激活TFH和B细胞有关。^125,134,136活化B细胞不仅可以分化为血浆B细胞，产生清除肿瘤细胞的抗体，还可以向CD4 T_H细胞呈递抗原，促进CD8 T细胞活化介导的免疫反应。¹³⁴ （注：T_N细胞原始T细胞，T_CM中央记忆T细胞，T_EM细胞效应记忆T细胞，T_H细胞辅助性T细胞，TFH细胞T滤泡辅助细胞，T_EFF细胞效应器Tcell，T_EX细胞衰竭T细胞，Tregs调节性T细胞，TAMs肿瘤相关巨噬细胞，DCs树突状细胞，cDC经典树突状细胞，FDC滤泡树突状细胞，GC生发中心，TLS三级淋巴结构，ICIs免疫检查点抑制剂，TME肿瘤微环境，NK自然杀伤细胞，APCs抗原提呈细胞，HLA人类白细胞抗原，Mye髓系细胞）。

综合评述

尽管研究历史漫长，但是直到近些年，随着肿瘤疫苗、过继细胞移植、免疫检查点抑制剂等多种治疗方式取得进步，肿瘤免疫治疗才开始显现成果。系统性地回顾肿瘤免疫治疗进展中具有里程碑意义的研究，有助于更好地了解各种免疫治疗方法的基本原理、优势和局限，从而有助于促进新策略的开发，以规避其缺点，获得最佳临床疗效。

尽管肿瘤免疫治疗已取得令人瞩目的进展，但仍存在一些缺陷和挑战，如患者对免疫治疗的反应率相对不高，临床疗效难以预测。此外，潜在的副作用，如自身免疫反应或细胞因子释放综合征，同样阻碍免疫治疗在临床上进一步应用²¹³。肿瘤浸润免疫细胞，尤其是T细胞，是肿瘤免疫治疗的基础，更好地了解肿瘤微环境中免疫细胞的作用对于解释免疫治疗的机制、确定预测性生物标记物和识别新的治疗靶点至关重要。尽管肿瘤微环境中异质性细胞群在一定程度上阻碍科学家详细描述肿瘤生态系统的特点，但单细胞技术的进步，特别是单细胞RNA测序和质谱流式细胞技术的进步，促进单个免疫细胞特性的研究进展。T细胞一直是这些分析的焦点，并且科学家已获得对T细胞表型和功能多样性在肿瘤免疫治疗中作用的重要生物学见解。系统地叙述肿瘤浸润免疫细胞在不同肿瘤中的特点，将有助于阐明肿瘤免疫反应的独特机制；因此，有必要对肿瘤浸润免疫细胞进行更全面的泛癌分析，以阐明不同肿瘤类型之间的差异。

肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，包含不同种类的肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。这些类型细胞之间的相互作用可以重塑肿瘤微环境并调节肿瘤进展。值得注意的是，肿瘤中的免疫细胞协同作用以控制肿瘤生长，而免疫治疗的效果依赖于固有免疫细胞和适应性免疫细胞的协调反应。²¹⁴ 尽管T细胞在肿瘤免疫治疗中起着关键作用，但肿瘤微环境这一复杂生态系统中复杂的细胞相互作用和相互交流表明，其他免疫细胞如髓样细胞、NK细胞和B细胞，在抗肿瘤免疫中同样发挥重要作用。²¹⁵ 事实上，最近的单细胞研究突显髓样细胞在人类肿瘤中的免疫调节作用，为异质髓细胞亚群的功能状态和发育谱系及其与免疫治疗的关系提供新的见解。^173,184,190 与T细胞相比，NK细胞作为抗肿瘤免疫的补充效应细胞，在肿瘤治疗中也发挥重要作用。重要的是，NK细胞激活涉及激活分子和抑制分子信号传导的整合，由于它们与T细胞中共刺激分子和共抑制分子的功能相似，因此呈现为潜在的靶点。²¹⁶ 由于B细胞具有多种功能，包括抗体生成、细胞因子分泌、抗原呈递和淋巴结构形成，在抗肿瘤免疫中的作用也日益受到重视。最新研究强调B细胞在肿瘤治疗中的重要作用及其在免疫治疗中的作用，然而其确切机制还需要进一步研究。^125,133,136

虽然最近单细胞研究通过“配体-受体对”的表达阐明肿瘤微环境中细胞-细胞相互作用，^217,218但仍需进一步实验验证；且越来越多证据表明细胞-细胞相互作用发生在肿瘤的不同空间区域或局部组织位点。^196,219 Moncada等将多模态交叉分析引入异质组织中不同群体的识别和空间定位，发现肿瘤微环境中细胞组分在空间上是有限制的富集，某些细胞类型表现出不同的协同聚集，以协同调节肿瘤的进展。²¹⁹ 值得注意的是，抗肿瘤免疫反应也被证明具有空间异质性。^220,221 Reuben等观察到同一肿瘤不同区域T细胞密度和克隆性存在广泛的空间差异，表明肿瘤内T细胞库存在异质性。²²² 与之一致的是，Losic等也证明肿瘤免疫相互作用的空间性，发现肿瘤相关免疫浸润呈现区域异质性，不同肿瘤区域显示不同程度的免疫克隆扩增和抗原特异性T细胞反应。²²¹ 

肿瘤免疫的空间异质性可能与肿瘤细胞内部的异质性有关。肿瘤细胞通常由不同的亚克隆组成，这些亚克隆所在区域的基因组、表型和抗原多样性也不尽相同。^223,224 不同肿瘤区域含有局部生成的新抗原，免疫系统可以感知这些新抗原，从而引发局部免疫反应，从而形成抗肿瘤免疫的空间格局。^{196,223,225,226} 而肿瘤内总T细胞受体可分为广谱T细胞受体和区域T细胞受体这一发现进一步证实种关联，且这些T细胞受体与肿瘤突变情况相对应。¹⁹⁶ 总的来说，这些发现能让我们更好地了解局部空间内免疫异质性和肿瘤内基因组异质性之间的重要联系，并强调在单细胞水平破译肿瘤微环境中细胞成分的复杂空间组成和结构的重要性。 

虽然单细胞RNA测序能够系统地描述肿瘤微环境中的细胞群体，但是肿瘤相关免疫细胞的空间组织和空间基因表达模式仍然知之甚少。目前正在开发许多旨在利用基于特定空间环境中细胞成像或测序方法来表征空间蛋白质组学或空间转录组学的技术，以提供关于异质组织中细胞和分子成分的多维信息。空间蛋白质组学检测的多重成像方法包括基于免疫荧光的方法，例如循环免疫荧光法，该方法反复收集低丛荧光图像，然后将其组装成高维进行显示。^227,228以及基于表位的方法，例如多路离子束成像和成像质谱仪，这两种技术都利用质谱仪进行读取和输出，并能以亚细胞级别的分辨率同时检测多达40种金属标记抗体。^229,230 空间转录组学定量是目前肿瘤研究中一个活跃的研究领域。荧光原位杂交（FISH）是确定RNA分子在其自然环境中空间位置和丰度的主要方法。在荧光原位杂交基础上，发展了一些改进方法，如单分子RNA成像方法，包括单分子RNA FISH、序列FISH和多重误差FISH等，^231–234 尽管这些检测方法在空间分辨率、定量精度和可描述特征的数量等方面性能不一，但多已被用来破译组织内细胞mRNA含量的空间信息。除了成像技术外，测序技术还涉及RNA分子的空间定量。原位测序，²³⁵ 特别是荧光原位RNA测序，能够在固定的细胞中原位分析转录组。²³⁶ 此外，体内转录组分析允许从单个活细胞的自然微环境中捕获mRNA^[237]。随着空间量化方法的进步，肿瘤相关免疫细胞的单细胞空间分布图将揭示出对抗肿瘤免疫至关重要的新参数。 

了解肿瘤细胞和免疫细胞在三维结构中的组成情况及相互作用将使我们更深入地了解肿瘤进展，并为提高当前免疫治疗的效率提供新方法。随着单细胞技术进一步发展，特别是空间映射和量化方法的改进，我们得以系统、全面地研究肿瘤微环境中不同免疫细胞和肿瘤细胞的原位相互作用及其治疗后的动态变化，这些进展将进一步推动肿瘤免疫治疗临床实践的成功。