生信论文新套路

1. 差异分析 (differential expression)；
2. 生存分析 (survial analysis)；
3. 相关分析 (correlation analysis)；
4. 组学分析 (genomic alterations)；
5. 突变分析 (mutational analysis)；
6. 免疫分析 (tumor infiltration analysis)。

感谢大家一直的支持。我们一直在分享肿瘤免疫浸润生信论文的技能、思路和写作。很多朋友对思路、技能和写作已经入门，但更多是缺乏对免疫浸润的认识。免疫浸润是一整套知识体系，是一种逻辑思维的方式，一旦拥有这种崭新的角度，作为医生，我们将能从更深刻地维度去认识肿瘤，去诊治病人。

我们有幸读到一篇免疫浸润的综述，内容系统，思路条理，逻辑层层递进，非常值得学习；更幸运的是，小伙伴们积极参与综述翻译，并顺利完成任务。感谢支持和参与。这篇论文是多位小伙伴参与完成，愿大家反复阅读，仔细推敲琢磨，可以留言讨论，也可以查阅参考文献。

根据综述主要内容，我们将综述分为上篇——免疫治疗和下篇——免疫浸润。对于从事肿瘤临床诊治和研究的医生来说，尽管这篇综述对于肿瘤免疫的基础知识涉及不多，但是高屋建瓴地提供认识肿瘤免疫的路径。肿瘤免疫基础知识我们会通过PPT（免费）和视频（收费）形式在公众号分享。请果友们多多关注。

综述论文                      

肿瘤免疫治疗历史与进展：肿瘤浸润免疫细胞的特征其治疗意义

张媛媛¹ 和 张泽民^1,2

免疫治疗使肿瘤治疗发生革命性改变，并使肿瘤免疫焕发出新活力。多种免疫治疗方法，如过继细胞移植治疗（ACT）和免疫检查点抑制剂（ICIs）已经获得持久的临床反应，但其疗效迥异，且只有部分肿瘤患者获益。肿瘤微环境（TME）中的免疫浸润在肿瘤发生、发展中发挥关键作用，并影响肿瘤患者的临床预后。全面剖析肿瘤浸润免疫细胞有助于阐明肿瘤-免疫逃逸的机制，从而为开发新的治疗策略提供机遇。然而，肿瘤微环境的高度异质性和可变性阻碍了对肿瘤内免疫细胞的准确分离。随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）和质谱流式细胞技术等单细胞技术的最新进展，使得系统地分析肿瘤微环境成为可能，并为解析肿瘤浸润免疫细胞的功能多样性提供机会。本文综述了肿瘤免疫治疗的最新进展，重点介绍具有里程碑意义的研究和肿瘤相关免疫细胞的单细胞特性，并总结肿瘤内免疫细胞的表型多样性及其与肿瘤免疫治疗的关系。本文可以加深我们对肿瘤免疫治疗进展的了解，有助于阐明免疫细胞在肿瘤进展中的调控作用，并为肿瘤治疗开发新型免疫治疗方法提供指导。

关键词：免疫治疗；肿瘤微环境；单细胞技术；肿瘤浸润免疫细胞；表型多样性

Cellular & Molecular Immunology (2020) 17:807–821; https://doi.org/10.1038/s41423-020-0488-6.

引言

肿瘤是一种基因组疾病，其特点是基因组不稳定，在肿瘤发展过程中会出现大量点突变积累和结构改变。^1,2 基因组学变化引起肿瘤抗原产生，而这些抗原会被免疫系统识别为非自身来源，并触发细胞免疫反应。^3,4 免疫系统之所以在免疫监视中发挥重要的作用，^4,5 是因为适应性和先天性免疫系统的免疫细胞浸润到肿瘤微环境（TME）以调控肿瘤进展。^6,7 固有免疫细胞由自然杀伤细胞（NK cell）、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和吞噬细胞（包括肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞 （DC））组成，通过直接杀伤肿瘤细胞或触发适应性免疫反应参与肿瘤抑制。^8–10适应性免疫系统的功能依赖于淋巴细胞（B细胞和T细胞），其中B细胞在体液免疫反应中起主要作用，而T细胞则参与细胞免疫反应。^5,11,12

有效的免疫应答既可以消灭肿瘤细胞，也可以损害肿瘤细胞的表型和功能。³ 然而，肿瘤细胞已经进化出多种机制以逃脱免疫监视，如抗原提呈机制缺陷、上调负调控通路、招募抑制性免疫细胞亚群^13–17，从而导致免疫细胞效应功能受阻，抗肿瘤免疫应答丧失。

免疫治疗旨在增强固有防御以消除肿瘤细胞，是肿瘤治疗的重大突破，并已革新肿瘤学领域。虽然释放宿主免疫系统来根除肿瘤的想法可追溯到一个世纪前，^18,19 但直到近期才在基础和临床研究上取得重大进展。多种肿瘤对免疫治疗有持久临床反应，^20–25 尽管应答率有限，且其潜在机制不明。²⁶免疫细胞是免疫治疗的基础；因此，了解肿瘤微环境中的免疫浸润是肿瘤治疗中提高反应率和开发新型免疫治疗策略的关键。虽然肿瘤免疫的“生态系统”高度复杂并由多种细胞组成，但是单细胞技术已成为解析肿瘤微环境的有力工具。²⁷ 尽管已经投入大量精力研究T细胞特性，但是固有和适应性免疫系统的其他免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和B细胞，也影响肿瘤进展和免疫治疗的反应。在本文中，我们将概述肿瘤免疫治疗的主要分类与发展历史，肿瘤浸润免疫细胞在人类肿瘤的最新研究结果及其与免疫治疗的关系和潜在临床应用。

图1.免疫治疗的主要种类。在临床实践中发展起来、具有广阔前景的肿瘤免疫免疫治疗形式包括：溶瘤病毒治疗、肿瘤疫苗、细胞因子治疗、过继细胞移植免疫治疗和免疫检查点抑制。本文描述每种治疗的基本原理及每步所涉及的细胞和分子基础。（注：DCs，树突状细胞；NK，自然杀伤细胞；TCR，T细胞受体；CAT-T嵌合抗原受体T细胞）

免疫治疗的主要种类

我们简要回顾已用于肿瘤治疗的免疫治疗的既往研究。这些研究促进主要几类免疫治疗的发展。（图1） 

溶瘤病毒治疗

一个多世纪以来，传统免疫治疗利用细菌或病毒感染来增强免疫应答。早在1863年，Virchow观察到肿瘤组织总是伴随着免疫系统的淋巴细胞浸润，首次发现肿瘤和炎症之间的联系。²⁸ 最早的肿瘤免疫治疗病例能追溯到1891年，免疫治疗之父--William Coley，首次尝试利用免疫系统治疗肿瘤，观察到活的和灭活化脓性链球菌和沙雷氏菌可能导致肉瘤患者的肿瘤消退。^29,30 虽然这种前卫的治疗策略为利用免疫系统治疗肿瘤提供一种验证性概念，但其作用机制及感染风险尚不明确。数十年后，溶瘤病毒治疗被发现，该方法利用转基因病毒感染肿瘤细胞，从而刺激产生促炎环境，增强全身性抗肿瘤免疫。^31,32 随着基因工程和病毒转染技术的进步，溶瘤病毒治疗近些年已经取得巨大进步。特别是talimogene laherparepvec（T-Vec，别名Imlygic），它是一种基因修饰的I型单纯疱疹病毒，对晚期黑色素瘤患者的临床疗效很好，并已被批准用于治疗不可切除的转移性黑色素瘤。³³

肿瘤疫苗

肿瘤疫苗利用肿瘤特异性抗原激活T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。之前报道的一项关键研究证实，MZ2-E和MZ2-D能被T细胞识别而激活免疫应答，MZ2-E和MZ2-D都是MAGE（黑色素瘤相关抗原）基因家族编码的抗原。^34,35 同时，在黑色素瘤患者体内肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）介导的免疫应答反应中，另一人类黑色素瘤抗原--gp100，被证明与肿瘤抑制相关。³⁶ 这些发现为肿瘤免疫治疗中利用肿瘤抗原作为疫苗奠定理论基础。除了肿瘤抗原，基于树突状细胞的疫苗也展示出显著的临床效果。树突状细胞是抗原提呈能力最强的抗原呈递细胞（APC），在活化抗肿瘤免疫中发挥关键作用。³⁷ 具体来说，肿瘤抗原激活的树突状细胞能内化、加工处理抗原，并将加工的表位提呈给T细胞，从而诱导毒性T淋巴细胞（CTL）免疫应答。³⁷ 由于树突状细胞在抗原提呈中的主要作用，因而在基于树突状细胞的疫苗中得到应用，其中涉及用分离到负载有肿瘤抗原或肿瘤细胞裂解物的树突状细胞，这些树突状细胞经体外确定成熟的鸡尾酒抗原刺激后再回输至患者体内。³⁸ 其中典型的例子是sipuleucel-T，该疫苗是基于树突状细胞的免疫治疗并已被批准用于晚期前列腺癌的治疗。³⁹ 此外，完整肿瘤细胞也可以用来激活自发免疫应答。GVAX是一种自体肿瘤细胞经基因修饰后分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的肿瘤疫苗，⁴⁰ 已在多种肿瘤类型中显示出增强肿瘤特异性免疫应答的潜力。^41–43 这些进展强调肿瘤疫苗在肿瘤治疗临床应用中的重要性。

细胞因子

细胞因子是由免疫细胞和非免疫细胞分泌以应对细胞内应激状态如感染、炎症和肿瘤的发生，其功能是作为调节免疫系统细胞内相互作用以及沟通的信号。⁴⁴ 分泌型细胞因子能够以复杂而高效的方式快速传递免疫信号，从而对靶抗原产生强有力的协同免疫应答。^44,45 细胞因子在肿瘤治疗中的潜在应用获益于1976年对白细胞介素2（IL-2）的认识。⁴⁶ IL-2最初被命名为T细胞生长因子，在体内、外都具有促进T细胞增殖的能力，从而发挥免疫刺激作用。^47–49 一个典型的细胞因子治疗案例是，在转移性肿瘤患者中大剂量应用IL-2可使肿瘤明显消退。^50,51 除IL-2外，在肿瘤治疗中，干扰素-α（IFN-α）也是一种经典细胞因子治疗。干扰素家族（IFNs）由大量细胞因子组成，其中属于I型干扰素的IFN-α是多效能细胞因子，是决定抗肿瘤免疫效果的关键因子。⁵² IFN-α在肿瘤控制中发挥多种角色，包括通过诱导细胞衰老和凋亡直接消灭肿瘤细胞，通过刺激树突状细胞成熟和增强T细胞的细胞毒性而促进有效的抗肿瘤免疫应答。⁵² 临床研究已经证实高剂量IFN-α对慢性髓系白血病和黑色素瘤的治疗作用。^53,54 尽管这些细胞因子具有临床益处，但耐受性差和毒副作用严重，使得细胞因子作为单一治疗的进一步应用受阻。不过，细胞因子与其他免疫治疗如过继细胞移植（ACT）联合应用仍在研究中，以规避细胞因子治疗的严重不良反应。

过继细胞移植

过继细胞移植（Adoptive cell transfer ACT）治疗使用自体免疫细胞，特别是T细胞。这些细胞经过分离或基因工程改造，体外扩增，之后重新输入患者体内以消灭癌细胞。过继细胞移植治疗已显示出持续的临床疗效。^55-57Rosenberg等证明向转移性肿瘤患者施用大剂量IL-2并联合输注自体淋巴因子激活杀伤细胞的治疗是有效的。⁵¹在首次成功过继免疫治疗试验之后，研究小组随后使用肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）改进这种方法，并证明IL-2扩增的肿瘤浸润淋巴细胞过继转移显示出更强的治疗效果。^58,59这些研究为使用肿瘤浸润淋巴细胞治疗晚期人类肿瘤提供了理论依据。

此后发现，将针对过度表达、自身衍生分化抗原的高选择性肿瘤反应性T细胞过继移植输注给转移性黑色素瘤患者，可导致肿瘤患者T细胞持续性克隆再增殖。⁶⁰以上做法提示，在过继转移中可使用针对特定新抗原的基因修饰T细胞。当前，已经发明了两种类型的基因修饰T细胞，即嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞和T细胞受体（T-cell receptor, TCR）工程改造的T细胞用于过继移植，并已经在恶性肿瘤治疗方面取得实质性进展。

CAR-T细胞治疗利用抗体片段来识别在癌细胞表面表达的特定抗原。第一代CAR-T细胞是通过表达免疫球蛋白-TCR嵌合分子作为功能性受体，具有抗体特异性的基因修饰T细胞。⁶¹然而，这些CAR-T细胞直到1998年才能够在体内持续存在。当时Maher等通过将CD28等共刺激分子引入到基因工程化CARs中，建立了新一代CAR-T细胞，使基因修饰T细胞能够在体内持续存在并保持活性。^62,63随后，他们证明CD19特异、CD28 / CD3-zeta双重信号CAR修饰T细胞可以诱导成人急性淋巴细胞白血病的分子缓解。⁶⁴此外，还研究了其他分子与CAR偶联时的功效。Porter等改造自体T细胞，使其表达与CD3-zeta和4–1BB信号域连接的抗CD19分子，用其靶向B细胞抗原CD19，发现这些被遗传修饰的自体T细胞可在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中产生强有力的CD19特异性免疫应答。⁶⁵这些发现揭示了CAR-T治疗在人类肿瘤治疗中的良好前景。Clay等首先报道用TCR工程改造的T细胞或TCR-T治疗方法。他们证明将TCR基因转移到黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞（PBL）中可以产生具有抗肿瘤反应性的效应T细胞。⁶⁶随后，当用TCR工程化T细胞治疗转移性黑色素瘤患者时，这种治疗的临床潜力得到证实。⁶⁷

值得注意的是，在肿瘤细胞中异常表达的典型肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1，^68,69已被转基因TCR-T细胞靶向，介导持续抗原特异性抗肿瘤作用，最终导致肿瘤退缩。^57,70因此，CAR-T细胞治疗和TCR-T细胞治疗都在肿瘤治疗方面取得实质性进展，并已取得令人鼓舞的临床效果。

免疫检查点抑制剂

尽管过继细胞移植治疗取得巨大进展，但一类新型的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）⁷¹即免疫检查点抑制剂（ICIs），现已进入医学实践，并成为最重要的免疫治疗方法之一。免疫检查点分子即共抑制信号传导途径的分子，其作用是维持免疫耐受，但经常被癌细胞利用以逃避免疫监视。^72,73免疫检查点抑制剂旨在通过阻断共抑制信号通路来恢复抗肿瘤免疫反应，并促进免疫介导的恶性细胞清除。^74,75 其最广泛使用的靶点是细胞毒性T淋巴细胞相关分子4（CTLA-4）、程序性细胞死亡受体1（PD-1）和程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）。

CTLA-4是一种在T细胞上表达的共抑制分子，具有负调节T细胞活化的功能。^76,77一项开创性研究表明，用抗体阻断CTLA-4可以诱导有效的免疫反应并导致肿瘤消退，⁷⁸开启了用抗体给免疫细胞”松开刹车”来增强抗肿瘤免疫反应的时代。^78,79经临床试验和疗效评估后，^20,80 CTLA-4单抗ipilimumab以其增强T细胞活化和持续诱导免疫反应的能力，成为首个被批准用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂。^20,81同时，PD-1被发现在T细胞表面表达，最初被认为参与程序性细胞死亡，⁸²后来证明PD-1是免疫反应的负调节分子。^83,84然而，PD-1的调节机制在其配体PD-L1的发现之前仍然是难以捉摸的。⁸⁵PD-L1在正常组织中表达，当与PD-1结合时，通过抑制TCR介导的淋巴细胞增殖和细胞因子分泌来调节免疫耐受。^86,87然而，肿瘤细胞也异常表达PD-L1以逃避免疫监视。^88,89研究表明，抑制PD-1或PD-L1可以恢复T细胞的细胞毒性能力并诱导肿瘤消退，^90,91提示PD-1或PD-L1可以作为治疗靶点。事实上，阻断PD-1通路已取得显著的临床效果，靶向PD-1或PD-L1的抗体已被批准用于治疗多种肿瘤 。^20,92

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