微 小 残 留 病 定 量 检 测 的 研 究 进 展
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近期写了篇 综述，已被中华医学实践录用，请大家先阅，多指教。
微 小 残 留 病 定 量 检 测 的 研 究 进 展
临床上多数急性白血病患者诊断时体内约有1010-1012个白血病细胞，经化疗后，可以降到108以下，临床和血液细胞学达到完全缓解，此时用传统形态学方法难以检测到。微小残留病(minimal residual disease，MRD)即指此种白血病患者经过治疗后体内仍残留白血病细胞的一种状态。现在许多学者认识到白血病的复发的原因是残留的白血病细胞克隆增殖的结果。因此，定量检测MRD对疗效评价，化疗方案的确定，预后判断，复发监测和移植物净化都有着重要的意义，也是近期研究的热点。本文就此领域的研究进展作一简要综述。
MRD的检测始于二十世纪七十年代末，到目前还未十分完善。国内外学者提出过多种方法以便检测出白血病患者缓解后体内残存的白血病细胞。早期方法的精确度，敏感度，特异性较差，如骨髓形态学检查，细胞培养，染色体检测，代谢酶测定等，只能粗略定性而已；八十年代末，九十年代初，随着分子生物学和流式细胞仪等检测方法提出，检测技术的精确度，敏感度，特异性不断提高，并逐步由定性检测发展到定量检测。
一：MRD检测方法 检测方法主要有分子生物学和分子免疫学方法。
1；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；目前PCR技术已成为分子生物学中最强有力和最普通的检测方法。PCR技术以其快速，灵敏，简便等优点被学者广泛应用于MRD研究。而PCR方法本身又在使用中不断地得到发展，形成了一系列适用于不同目的的特殊方法。目前常用于定量监测MRD的PCR技术类型有（1）极限稀释法（2）竞争性定量ＰＣＲ，（3）定量逆转录PCR，（4）荧光定量PCR和实时定量PCR等
1．1；极限稀释法（limiting dilution quantitative PCR）；即作一系列依倍稀释管（常见以10倍数稀释），由其PCR扩增阴性管的稀释度即可确定极限稀释的倍数计算出此稀释度时PCR反应液中的目的基因含量。此法操作简单，可有效扩增不同目的基因，且得到的信号强而清晰。1996年Ouspenskaia MV［1］等利用基因定量检测MRD水平就是此法应用。但本法定量不准确，只能半定量，且操作时易被污染，近两年来国外使用的学者渐少。
1．2；竞争性定量PCR（quantitative competitive-PCR）；即在反应体系中靶基因的扩增与已知量的内参照模板进行竞争，通过所扩增的内参照模板的量作一线性图，来对目标基因定量。由于待测模板与内参照模板序列相同或相近，易形成异源双链，影响了精确定量，目前已经在定量检测中较少单独使用，常与其他方法联合形成新的方法，如竞争性巢式PCR等。Guo JQ［2］等比较竞争性巢式PCR与实时定量PCR在BCR-ABL融合基因上的差异，选取285位经STI-571、干扰素或骨髓移植治疗患者的435份外周血或骨髓样本，采用竞争性巢式PCR、实时定量PCR、FISH和Western blotting等方法检测Bcr-Abl，结果表明实时定量PCR敏感度稍逊于手工竞争性巢式PCR。但手工操作对操作员的要求较高，且不能同时大样本进行，只见于科学研究中，临床上难以大规模应用。
1．3；定量逆转录PCR（quantitative reverse transcriptase）；即先将靶mRNA逆转录成靶cDNA，然后靶cDNA的扩增与在反应体系中事先加入的已知量的片断进行竞争，通过所扩增的竞争性片断的量作一线性图，来对目标片段定量。本法实际是逆转录PCR和竟争性定量PCR的联合。优点是扩增RNA分子的序列非常灵敏，能够在复杂的来源中检测和分离cDNA序列，比常规文库为基础的cDNA克隆方法有很多优越性；速度快，材料少，能以细胞总RNA为材料不受大量污染tRNA和rRNA的影响。近年来被许多学者用于MRD的检测，取得了较多的成果。早在1996年，Kazushi Inoue［3］等应用RT-PCR检测WT1在白血病患者治疗后的表达，31人常规化疗,23人骨髓移植,，发现WT1基因表达的水平与预后有着明显关联:WT1表达水平愈低，其完全缓解率更高，无病生存期和总生存期更长；慢性粒细胞白血病患者慢性期WT1非常低，随至进展期和急变期逐渐增高，与病情有一定的关联。
1，4；实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RQ-PCR）和荧光定量PCR（Fluorescence Quantitive PCR，FQ-PCR） 都是基于荧光能量传递技术（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），通过检测PCR过程的荧光讯号而得知靶基因的初始浓度。目前常用的复合探针法是综合了Roche和MB两种技术的优点而改进的定量PCR方法。RQ-PCR和FQ-PCR的应用简化了检测过程，其反应速度快，灵敏度高，特异性强，可重复性好，是目前国外学者研究MRD首选的检测手段。 Nakagawa T［4］等利用RQ-PCR 监测7位AML患者的MRD，其染色体异常为t（8；21），其中4人行化疗加异基因骨髓移植治疗，另3人治疗仅为化疗。结果显示；Allo-BMT中有2人经历复发，其AML1-MTG8 mRNA被显示有数量上的增长，在反复化疗和供体淋巴输注后完全缓解，AML1-MTG8表达水平下降。同样地Marcucci［5］等用PQ-PCR扩增CBFβ/MYH11融合转录本已用于MRD监测和评估具有inv（16）（p13q22）的AML患者的危险性。
2;流式细胞术（flow cytometry，FCM）是通过测量射门参数在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特征。其优点速度快，每秒可检测5000～10000个细胞；自动化，可以用计算机记录处理并对各个细胞进行多参数分析；敏感性高，可达10-4，仅次于PCR。现有部分研究者利用单克隆抗体结合多色荧光标记，极大地提高了FCM在MRD检测的特异性和敏感性，促进了FCM在临床上的推广应用。Bjorklund E［6］等利用流式细胞术和活/射门分析技术随访70位儿童争淋患者，中位数53个月，发现预后与白血病残留水平密切相关，认为该技术对进一步的研究和提高疗效有较高价值。
3；荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是通过特定分子的标记探针与染色体原位杂交和荧光显色，测定中期染色体和间期细胞核中特定的DNA序列的一种基因分析技术。现随着外荧光滤色片制备技术的提高，应用不同的外荧光滤色征组合，使之改进为多色荧光原位杂交技术（multicolor FISH，M-FISH）。Varella-Garcia M［7］等将CD34+细胞分选结合应用FISH对t（8；21）阳性的AML进行MRD检测，弥补了FISH的假阳性，同时间接提供了残留t（8；21）细胞分化状态的信息。
4；多种方法结合应用，
目前检测MRD的方法各有优缺点，至今尚未有一种能代替上述各种方法优点的检测手段，许多学者就联合两种或多种检测方法来研究MRD，取得了较好的效果。Rasmussen T［8］等基于5’nuclease Taqman技术建立real-time PCR，结合等位基因特异性核苷酸探针技术用以研究和监测多发性骨髓瘤治疗后的肿瘤负荷情况。发现多发性骨髓瘤患者行外周血干细胞移植术后，可达到完全缓解，但定量监测其MRD还残留有恶性细胞，同时阐明MM骨髓中内容物潜在问题是骨髓的不均一浸润。
二，监测指标及临床意义
1；免疫学指标—人白细胞分化抗原；白细胞分化抗原是白细胞（还包括血小板，血管内皮细胞）在正常分化成熟不同谱系和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。白血病是造血细胞恶性克隆增殖，白血病细胞往往发育停滞在某一分化阶段，经常出现混乱或不常见的表型，如抗原过度表达、抗原表达不同步及系列失真。通常可用于MRD检测的白血病细胞抗原表达的特点有（1）粒系和淋系相关抗原共表达；（2）某些抗原的过度表达或出现异常抗原表型；（3）正常抗原表达的缺损或减少。Andy C，Rawstron等［9］用流式细胞仪检测CD19/CD5/CD20/CD79b在慢性淋巴细胞性白血病的表达时发现，MRD－（＜0.01×109/L＝患者的总生存率和无病生存质量与MRD＋的患者有着明显的差异。
2；WT1基因:WT1基因是最早发现的与Wilm肿瘤发生有关的基因，位于11p13，编码一个分子量5.2~5.4万的4个锌指结构的结合蛋白，具有转录调控功能。目前被认为是血液系统各种疾病的共有标志，正常人难以检测到WT1的表达，而几乎在所有的白血病中都能检测到，其转录动力学与疾病进程和预后密切相关［3］。尤其要指出的是，Ogawa H［10］等在Kazushi Inoue［3］的基础上进一步,在骨髓移植的患者通过检测WT1基因的表达来监测MRD,阳性者即通过供者淋巴细胞输注治疗,效果良好,结果无GVHD和再生不良的发生.这表明监测MRD不仅可以预测病情,还可以指导治疗,有着重大的临床价值.
3；P15基因甲基化；P15基因是一个重要的抑癌基因，定位于9P21，该基因操纵区内5’—CpG岛高度甲基化导致其功能的失活，为恶性肿瘤细胞所特有，故些学者利用其作为一项监测MRD指标。Chim CS［11］等用甲基化特异性PCR监测15例急性早幼粒细胞性白血病患者病情；发现其中 4例患者P15基因甲基化阴性保持持续缓解，，有11例患者P15基因甲基化阳性，持续阳性者复发，两组的5年生存率有统计学意义。
4；白血病遗传学指标；白血病常有细胞染色体及融合基因的异常，见下表：
染色体异常
融合基因
常见的白血病类型
染色体异常
融合基因
常见的白血病类型
t(9,22)
BCR-ABL
CML* ；前B-ALL
t(1,19)
PBX-E2α
前B-ALL
t(15,17)
PML-RARα
ANLL-M3*
t(4,11)
MLL-AF4
前B-ALL
t(9,11)
HRX-AF9
ANLL-M4,M5；ALL
t(6,9)
DEK-CAN
ANLL-M2
t(12,21)
TEL/AML1
前B-ALL
t(3,5)
NPM-MLF1
ANLL-M6
t(11,14)
TTG2-TCRα/δ
T-ALL
t(10,11)
CALM-AF10
ANLL-M0,M4
t(11,19)
HRX-ENL
ANLL-M4,M5；ALL
t(6,9)
DEK-CAN
ANLL-M2
t(1,14)
TAL1-TCRδ
T-ALL
t(8,21)
AML1-ETO
ANLL-M2*；前B-ALL
inv(16)
CBFβ-MYHⅡ
ANLL-M4EO *
t(3,5)
NPM-MLF1
ANLL-M6
（带*预后较好）
其中部分染色体及其对应的融合基因具有独立的预后价值和诊断价值。伴随染色体易位的基因改变或异常基因转录物是目前MRD检测的主要分子标记，现将常用的基因简述如下：
4.1；TCR/IgH基因重排；T细胞受体（TCR）和免疫球蛋白（Ig）基因包括V、D、J、C等多组不连续基因片段。重排后，各基因片段之间的距离明显缩短，与C基因相比较，V、D、J基因片段数量较多，又有较高的可变性，故特异性较高，这样，可根据诊断时所确定的TCR/IgH基因重排序列来监测MRD的存在。Gruhn B［12］等通过定量检测克隆特异的IgH重排基因的表达来对26例B-ALL进行微量残留病(MRD)动态定量检测和化疗效应差异的定量评价。结果表明所有阴性患者（19例）目前都持续缓解（平均63个月），而7例阳性患者中有4例复发，（复发时间平均21个月），而3例IgH重排基因低水平表达的患者（＜2×10-5＝未见复发。
4.2；PML-RARα融合基因，为急性早幼粒细胞性白血病特异性融合基因，常被用于监测APL病情变化。Gallagher RE等［13］引进PML-RARα标准系数（normdalize quotient ；NQ）就是PML-RARα的mRNA 考贝数被分割转换成看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶mRNA的考贝数，采用实时定量逆转录PCR方法监测123名患者，发现最开始由全反式维甲酸诱导达完全缓解的患者的NQ比由化疗达完全缓解的患者的NQ低：巩固化疗后NQ超过10(-5)易复发。为临床提供了治疗和预后的判断依据。
4.3；TEL/AML1融合基因 TEL基因位于12q13，是ETS基因家族的成员，与其他基因共同组成融合基因导致白血病的发生。儿童急淋中常见t（12；21）易位，产生的TEL/AML1融合基因常被学者作为检测MRD的标记。Madzo J等［14］用实时定量PCR方法，在57例诊断的TEL/AML1阳性急性淋巴细胞白血病儿童新患者中，分析其治疗后33天残留病存在的情况，13%的患者阳性（10-2～10-4），13%的患者为弱阳性（≤10-4），其它为阴性。结果证实了TEL/AML1阳性儿童急淋疗效比阴性患者好。
此外，还有 BCR-ABL［15］［16］和AML1-ETO［17］等常被用来定量监测MRD。
三；结语
急性白血病微小残留病是白血病复发的根原，因此，检测MRD不仅仅是用来作为判断白血病患者预后的标记，还可以指在化疗方案的选择，新药品[16]、新疗法［4］［10］疗效的判断起重要作用。通过监测到MRD的存在，有人［4］［10］输注供者淋巴细胞而提高生存期和生存质量，有人［18］则加用特异抗体来提高整个治疗的疗效。这表明监测MRD不仅可以预测病情,还可以指导治疗,有着明确的临床价值.目前我国尚未普遍开展MRD的检测及实验室方法和标记物的标准化，相信随着检测方法的改进和推广，MRD的监测会在临床上广泛应用而造福于广大白血病患者。
[参考文献]
［1］Ouspenskaia MV,Johnston DA,Roberts WM; et al. Accurate quantitation of residual B-precursor acute lymphoblastic leukemia by limiting dilution and a PCR-based detection system: a description of the method and the principles involved. Leukemia 1995 Feb;9(2):321-8
［2］Guo JQ，Lin H，Kantarjian H，Talpaz M；et al. Comparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients. Leukemia 2002 Dec；16（12）：2447-53
［3］K Inoue, H Ogawa, T Yamagami et al Blood,Vol 88,No6(September 15),1996: 2267-78 Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 (Wilms tumor gene) expression levels
［4］Sugimoto T, Das H, Imoto S Nakagawa，T;Das,H;Imoto,S: Quantitation of minimal residual disease in t(8;21)-positive acute myelogenous leukemia patients using real-time quantitative RT-PCR.Am-J-Heamatol,2000 Jun;64(2);101-6
［5］Marcucci G，Caligiuri MA，Dohner H，et al。Quantification of CBFbeta/MYH11 fusion transcript by real time RT-PCR in patients with INV(16) acute myeloid leukemia. Leukemia，2001，15（7）：1072-80
［6］Bjorklund E,Mazur J,Soderhall S. et al. Flow cytometric follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukemia Leukemia 2003 Jan:17(1);138-48
［7］Varella-Garcia M，Hogan CJ，Odom LF，et al；Minimal residual disease (MRD) in remission t(8;21) AML and in vivo differentiation detected by FISH and CD34+ cell sorting Leukemia，2001，15（9）：1408-1414
［8］Rasmussen T；Poulsen TS；Honore L；Johnsen HE et al. Quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using an allele-specific real-time PCR assay. Exp-Hematol 2000。Sep；28（9）：1039-45
［9］Andy C.Rawstron,Ben Kennedy,Paul A.S.Evans,et al. uantitation of minimal disease levels in chronic lymphocytic leukemia using a sensitive flow cytometric assay improves the prediction of outcome and can be used to optimize therapy Blood,2001 July.Volume98,29-35
［10］Ogawa H,Tsubo A,Oji Y et al Successful donor leukocyte transfusion at molecular relapse for a patient with acute myeloid leukemia who was treated with allogenic bone marrow
transplantation: importance of the monitoring of minimal residual disease by WT1
assay. Bone-Marrow-Transplant.1998.Mar,21(5);525-7
［11］Chim CS,Liang R,tam CY.et al. Methylation of p15 and p16 genes in acute promyelocytic leukemia: potential diagnostic and prognostic significance J Chin Oncol,2001,19(7): 2033-2040
［12］Gruhn B,Hongeng S,Yi H,et al. Minimal residual disease after intensive induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia predicts outcome.Leukemia,1998, may (5),12;675O
［13］Robert E. Gallagher, Beow Y. Yeap, Wanli Bi；Blood 2003 Apr 1;101(7):2521-8 Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RAR mRNA in acute promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129
［14］Madzo J,Zuna J,Muzikova M et al Slower molecular response to treatment predicts poor outcome in patients with TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia: prospective real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction study. Caner,2003 Jan(1):105-13
［15］Guo JQ, Lin H, Kantarjian H et al omparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients Leukemia 2002 Dec;16(12):2447-53
［16］Kantarjian HM, Cortes JE, O'Brien S et al Imatinib mesylate therapy in newly diagnosed patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia: high incidence of early complete and major cytogenetic responses. Blood 2003 Jan 1;101(1):97-100
［17］Barragan E, Bolufer P, Moreno I Quantitative detection of AML1-ETO rearrangement by real-time RT-PCR using fluorescently labeled probes Leuk Lymphoma 2001 Aug;42(4):747-56
［18］Jurcic JG. Antibody therapy for residual disease in acute myelogenous leukemia Crit Rev Oncol Hematol 2001 Apr;38(1):37-45
微 小 残 留 病 定 量 检 测 的 研 究 进 展
临床上多数急性白血病患者诊断时体内约有1010-1012个白血病细胞，经化疗后，可以降到108以下，临床和血液细胞学达到完全缓解，此时用传统形态学方法难以检测到。微小残留病(minimal residual disease，MRD)即指此种白血病患者经过治疗后体内仍残留白血病细胞的一种状态。现在许多学者认识到白血病的复发的原因是残留的白血病细胞克隆增殖的结果。因此，定量检测MRD对疗效评价，化疗方案的确定，预后判断，复发监测和移植物净化都有着重要的意义，也是近期研究的热点。本文就此领域的研究进展作一简要综述。
MRD的检测始于二十世纪七十年代末，到目前还未十分完善。国内外学者提出过多种方法以便检测出白血病患者缓解后体内残存的白血病细胞。早期方法的精确度，敏感度，特异性较差，如骨髓形态学检查，细胞培养，染色体检测，代谢酶测定等，只能粗略定性而已；八十年代末，九十年代初，随着分子生物学和流式细胞仪等检测方法提出，检测技术的精确度，敏感度，特异性不断提高，并逐步由定性检测发展到定量检测。
一：MRD检测方法 检测方法主要有分子生物学和分子免疫学方法。
1；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；目前PCR技术已成为分子生物学中最强有力和最普通的检测方法。PCR技术以其快速，灵敏，简便等优点被学者广泛应用于MRD研究。而PCR方法本身又在使用中不断地得到发展，形成了一系列适用于不同目的的特殊方法。目前常用于定量监测MRD的PCR技术类型有（1）极限稀释法（2）竞争性定量ＰＣＲ，（3）定量逆转录PCR，（4）荧光定量PCR和实时定量PCR等
1．1；极限稀释法（limiting dilution quantitative PCR）；即作一系列依倍稀释管（常见以10倍数稀释），由其PCR扩增阴性管的稀释度即可确定极限稀释的倍数计算出此稀释度时PCR反应液中的目的基因含量。此法操作简单，可有效扩增不同目的基因，且得到的信号强而清晰。1996年Ouspenskaia MV［1］等利用基因定量检测MRD水平就是此法应用。但本法定量不准确，只能半定量，且操作时易被污染，近两年来国外使用的学者渐少。
1．2；竞争性定量PCR（quantitative competitive-PCR）；即在反应体系中靶基因的扩增与已知量的内参照模板进行竞争，通过所扩增的内参照模板的量作一线性图，来对目标基因定量。由于待测模板与内参照模板序列相同或相近，易形成异源双链，影响了精确定量，目前已经在定量检测中较少单独使用，常与其他方法联合形成新的方法，如竞争性巢式PCR等。Guo JQ［2］等比较竞争性巢式PCR与实时定量PCR在BCR-ABL融合基因上的差异，选取285位经STI-571、干扰素或骨髓移植治疗患者的435份外周血或骨髓样本，采用竞争性巢式PCR、实时定量PCR、FISH和Western blotting等方法检测Bcr-Abl，结果表明实时定量PCR敏感度稍逊于手工竞争性巢式PCR。但手工操作对操作员的要求较高，且不能同时大样本进行，只见于科学研究中，临床上难以大规模应用。
1．3；定量逆转录PCR（quantitative reverse transcriptase）；即先将靶mRNA逆转录成靶cDNA，然后靶cDNA的扩增与在反应体系中事先加入的已知量的片断进行竞争，通过所扩增的竞争性片断的量作一线性图，来对目标片段定量。本法实际是逆转录PCR和竟争性定量PCR的联合。优点是扩增RNA分子的序列非常灵敏，能够在复杂的来源中检测和分离cDNA序列，比常规文库为基础的cDNA克隆方法有很多优越性；速度快，材料少，能以细胞总RNA为材料不受大量污染tRNA和rRNA的影响。近年来被许多学者用于MRD的检测，取得了较多的成果。早在1996年，Kazushi Inoue［3］等应用RT-PCR检测WT1在白血病患者治疗后的表达，31人常规化疗,23人骨髓移植,，发现WT1基因表达的水平与预后有着明显关联:WT1表达水平愈低，其完全缓解率更高，无病生存期和总生存期更长；慢性粒细胞白血病患者慢性期WT1非常低，随至进展期和急变期逐渐增高，与病情有一定的关联。
1，4；实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RQ-PCR）和荧光定量PCR（Fluorescence Quantitive PCR，FQ-PCR） 都是基于荧光能量传递技术（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），通过检测PCR过程的荧光讯号而得知靶基因的初始浓度。目前常用的复合探针法是综合了Roche和MB两种技术的优点而改进的定量PCR方法。RQ-PCR和FQ-PCR的应用简化了检测过程，其反应速度快，灵敏度高，特异性强，可重复性好，是目前国外学者研究MRD首选的检测手段。 Nakagawa T［4］等利用RQ-PCR 监测7位AML患者的MRD，其染色体异常为t（8；21），其中4人行化疗加异基因骨髓移植治疗，另3人治疗仅为化疗。结果显示；Allo-BMT中有2人经历复发，其AML1-MTG8 mRNA被显示有数量上的增长，在反复化疗和供体淋巴输注后完全缓解，AML1-MTG8表达水平下降。同样地Marcucci［5］等用PQ-PCR扩增CBFβ/MYH11融合转录本已用于MRD监测和评估具有inv（16）（p13q22）的AML患者的危险性。
2;流式细胞术（flow cytometry，FCM）是通过测量射门参数在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特征。其优点速度快，每秒可检测5000～10000个细胞；自动化，可以用计算机记录处理并对各个细胞进行多参数分析；敏感性高，可达10-4，仅次于PCR。现有部分研究者利用单克隆抗体结合多色荧光标记，极大地提高了FCM在MRD检测的特异性和敏感性，促进了FCM在临床上的推广应用。Bjorklund E［6］等利用流式细胞术和活/射门分析技术随访70位儿童争淋患者，中位数53个月，发现预后与白血病残留水平密切相关，认为该技术对进一步的研究和提高疗效有较高价值。
3；荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是通过特定分子的标记探针与染色体原位杂交和荧光显色，测定中期染色体和间期细胞核中特定的DNA序列的一种基因分析技术。现随着外荧光滤色片制备技术的提高，应用不同的外荧光滤色征组合，使之改进为多色荧光原位杂交技术（multicolor FISH，M-FISH）。Varella-Garcia M［7］等将CD34+细胞分选结合应用FISH对t（8；21）阳性的AML进行MRD检测，弥补了FISH的假阳性，同时间接提供了残留t（8；21）细胞分化状态的信息。
4；多种方法结合应用，
目前检测MRD的方法各有优缺点，至今尚未有一种能代替上述各种方法优点的检测手段，许多学者就联合两种或多种检测方法来研究MRD，取得了较好的效果。Rasmussen T［8］等基于5’nuclease Taqman技术建立real-time PCR，结合等位基因特异性核苷酸探针技术用以研究和监测多发性骨髓瘤治疗后的肿瘤负荷情况。发现多发性骨髓瘤患者行外周血干细胞移植术后，可达到完全缓解，但定量监测其MRD还残留有恶性细胞，同时阐明MM骨髓中内容物潜在问题是骨髓的不均一浸润。
二，监测指标及临床意义
1；免疫学指标—人白细胞分化抗原；白细胞分化抗原是白细胞（还包括血小板，血管内皮细胞）在正常分化成熟不同谱系和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。白血病是造血细胞恶性克隆增殖，白血病细胞往往发育停滞在某一分化阶段，经常出现混乱或不常见的表型，如抗原过度表达、抗原表达不同步及系列失真。通常可用于MRD检测的白血病细胞抗原表达的特点有（1）粒系和淋系相关抗原共表达；（2）某些抗原的过度表达或出现异常抗原表型；（3）正常抗原表达的缺损或减少。Andy C，Rawstron等［9］用流式细胞仪检测CD19/CD5/CD20/CD79b在慢性淋巴细胞性白血病的表达时发现，MRD－（＜0.01×109/L＝患者的总生存率和无病生存质量与MRD＋的患者有着明显的差异。
2；WT1基因:WT1基因是最早发现的与Wilm肿瘤发生有关的基因，位于11p13，编码一个分子量5.2~5.4万的4个锌指结构的结合蛋白，具有转录调控功能。目前被认为是血液系统各种疾病的共有标志，正常人难以检测到WT1的表达，而几乎在所有的白血病中都能检测到，其转录动力学与疾病进程和预后密切相关［3］。尤其要指出的是，Ogawa H［10］等在Kazushi Inoue［3］的基础上进一步,在骨髓移植的患者通过检测WT1基因的表达来监测MRD,阳性者即通过供者淋巴细胞输注治疗,效果良好,结果无GVHD和再生不良的发生.这表明监测MRD不仅可以预测病情,还可以指导治疗,有着重大的临床价值.
3；P15基因甲基化；P15基因是一个重要的抑癌基因，定位于9P21，该基因操纵区内5’—CpG岛高度甲基化导致其功能的失活，为恶性肿瘤细胞所特有，故些学者利用其作为一项监测MRD指标。Chim CS［11］等用甲基化特异性PCR监测15例急性早幼粒细胞性白血病患者病情；发现其中 4例患者P15基因甲基化阴性保持持续缓解，，有11例患者P15基因甲基化阳性，持续阳性者复发，两组的5年生存率有统计学意义。
4；白血病遗传学指标；白血病常有细胞染色体及融合基因的异常，见下表：
染色体异常
融合基因
常见的白血病类型
染色体异常
融合基因
常见的白血病类型
t(9,22)
BCR-ABL
CML* ；前B-ALL
t(1,19)
PBX-E2α
前B-ALL
t(15,17)
PML-RARα
ANLL-M3*
t(4,11)
MLL-AF4
前B-ALL
t(9,11)
HRX-AF9
ANLL-M4,M5；ALL
t(6,9)
DEK-CAN
ANLL-M2
t(12,21)
TEL/AML1
前B-ALL
t(3,5)
NPM-MLF1
ANLL-M6
t(11,14)
TTG2-TCRα/δ
T-ALL
t(10,11)
CALM-AF10
ANLL-M0,M4
t(11,19)
HRX-ENL
ANLL-M4,M5；ALL
t(6,9)
DEK-CAN
ANLL-M2
t(1,14)
TAL1-TCRδ
T-ALL
t(8,21)
AML1-ETO
ANLL-M2*；前B-ALL
inv(16)
CBFβ-MYHⅡ
ANLL-M4EO *
t(3,5)
NPM-MLF1
ANLL-M6
（带*预后较好）
其中部分染色体及其对应的融合基因具有独立的预后价值和诊断价值。伴随染色体易位的基因改变或异常基因转录物是目前MRD检测的主要分子标记，现将常用的基因简述如下：
4.1；TCR/IgH基因重排；T细胞受体（TCR）和免疫球蛋白（Ig）基因包括V、D、J、C等多组不连续基因片段。重排后，各基因片段之间的距离明显缩短，与C基因相比较，V、D、J基因片段数量较多，又有较高的可变性，故特异性较高，这样，可根据诊断时所确定的TCR/IgH基因重排序列来监测MRD的存在。Gruhn B［12］等通过定量检测克隆特异的IgH重排基因的表达来对26例B-ALL进行微量残留病(MRD)动态定量检测和化疗效应差异的定量评价。结果表明所有阴性患者（19例）目前都持续缓解（平均63个月），而7例阳性患者中有4例复发，（复发时间平均21个月），而3例IgH重排基因低水平表达的患者（＜2×10-5＝未见复发。
4.2；PML-RARα融合基因，为急性早幼粒细胞性白血病特异性融合基因，常被用于监测APL病情变化。Gallagher RE等［13］引进PML-RARα标准系数（normdalize quotient ；NQ）就是PML-RARα的mRNA 考贝数被分割转换成看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶mRNA的考贝数，采用实时定量逆转录PCR方法监测123名患者，发现最开始由全反式维甲酸诱导达完全缓解的患者的NQ比由化疗达完全缓解的患者的NQ低：巩固化疗后NQ超过10(-5)易复发。为临床提供了治疗和预后的判断依据。
4.3；TEL/AML1融合基因 TEL基因位于12q13，是ETS基因家族的成员，与其他基因共同组成融合基因导致白血病的发生。儿童急淋中常见t（12；21）易位，产生的TEL/AML1融合基因常被学者作为检测MRD的标记。Madzo J等［14］用实时定量PCR方法，在57例诊断的TEL/AML1阳性急性淋巴细胞白血病儿童新患者中，分析其治疗后33天残留病存在的情况，13%的患者阳性（10-2～10-4），13%的患者为弱阳性（≤10-4），其它为阴性。结果证实了TEL/AML1阳性儿童急淋疗效比阴性患者好。
此外，还有 BCR-ABL［15］［16］和AML1-ETO［17］等常被用来定量监测MRD。
三；结语
急性白血病微小残留病是白血病复发的根原，因此，检测MRD不仅仅是用来作为判断白血病患者预后的标记，还可以指在化疗方案的选择，新药品[16]、新疗法［4］［10］疗效的判断起重要作用。通过监测到MRD的存在，有人［4］［10］输注供者淋巴细胞而提高生存期和生存质量，有人［18］则加用特异抗体来提高整个治疗的疗效。这表明监测MRD不仅可以预测病情,还可以指导治疗,有着明确的临床价值.目前我国尚未普遍开展MRD的检测及实验室方法和标记物的标准化，相信随着检测方法的改进和推广，MRD的监测会在临床上广泛应用而造福于广大白血病患者。
[参考文献]
［1］Ouspenskaia MV,Johnston DA,Roberts WM; et al. Accurate quantitation of residual B-precursor acute lymphoblastic leukemia by limiting dilution and a PCR-based detection system: a description of the method and the principles involved. Leukemia 1995 Feb;9(2):321-8
［2］Guo JQ，Lin H，Kantarjian H，Talpaz M；et al. Comparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients. Leukemia 2002 Dec；16（12）：2447-53
［3］K Inoue, H Ogawa, T Yamagami et al Blood,Vol 88,No6(September 15),1996: 2267-78 Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 (Wilms tumor gene) expression levels
［4］Sugimoto T, Das H, Imoto S Nakagawa，T;Das,H;Imoto,S: Quantitation of minimal residual disease in t(8;21)-positive acute myelogenous leukemia patients using real-time quantitative RT-PCR.Am-J-Heamatol,2000 Jun;64(2);101-6
［5］Marcucci G，Caligiuri MA，Dohner H，et al。Quantification of CBFbeta/MYH11 fusion transcript by real time RT-PCR in patients with INV(16) acute myeloid leukemia. Leukemia，2001，15（7）：1072-80
［6］Bjorklund E,Mazur J,Soderhall S. et al. Flow cytometric follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukemia Leukemia 2003 Jan:17(1);138-48
［7］Varella-Garcia M，Hogan CJ，Odom LF，et al；Minimal residual disease (MRD) in remission t(8;21) AML and in vivo differentiation detected by FISH and CD34+ cell sorting Leukemia，2001，15（9）：1408-1414
［8］Rasmussen T；Poulsen TS；Honore L；Johnsen HE et al. Quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using an allele-specific real-time PCR assay. Exp-Hematol 2000。Sep；28（9）：1039-45
［9］Andy C.Rawstron,Ben Kennedy,Paul A.S.Evans,et al. uantitation of minimal disease levels in chronic lymphocytic leukemia using a sensitive flow cytometric assay improves the prediction of outcome and can be used to optimize therapy Blood,2001 July.Volume98,29-35
［10］Ogawa H,Tsubo A,Oji Y et al Successful donor leukocyte transfusion at molecular relapse for a patient with acute myeloid leukemia who was treated with allogenic bone marrow
transplantation: importance of the monitoring of minimal residual disease by WT1
assay. Bone-Marrow-Transplant.1998.Mar,21(5);525-7
［11］Chim CS,Liang R,tam CY.et al. Methylation of p15 and p16 genes in acute promyelocytic leukemia: potential diagnostic and prognostic significance J Chin Oncol,2001,19(7): 2033-2040
［12］Gruhn B,Hongeng S,Yi H,et al. Minimal residual disease after intensive induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia predicts outcome.Leukemia,1998, may (5),12;675O
［13］Robert E. Gallagher, Beow Y. Yeap, Wanli Bi；Blood 2003 Apr 1;101(7):2521-8 Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RAR mRNA in acute promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129
［14］Madzo J,Zuna J,Muzikova M et al Slower molecular response to treatment predicts poor outcome in patients with TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia: prospective real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction study. Caner,2003 Jan(1):105-13
［15］Guo JQ, Lin H, Kantarjian H et al omparison of competitive-nested PCR and real-time PCR in detecting BCR-ABL fusion transcripts in chronic myeloid leukemia patients Leukemia 2002 Dec;16(12):2447-53
［16］Kantarjian HM, Cortes JE, O'Brien S et al Imatinib mesylate therapy in newly diagnosed patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia: high incidence of early complete and major cytogenetic responses. Blood 2003 Jan 1;101(1):97-100
［17］Barragan E, Bolufer P, Moreno I Quantitative detection of AML1-ETO rearrangement by real-time RT-PCR using fluorescently labeled probes Leuk Lymphoma 2001 Aug;42(4):747-56
［18］Jurcic JG. Antibody therapy for residual disease in acute myelogenous leukemia Crit Rev Oncol Hematol 2001 Apr;38(1):37-45
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