作者：贺梨萍 来源：澎湃新闻 发布时间：2020/6/16

受体研究揭示新冠中间宿主范围比SARS窄，穿山甲概率低

 近几十年来，冠状病毒大流行已对全球公共卫生构成巨大威胁。典型的例子是，SARS病毒在2003年导致非典大流行，SARS-CoV-2则导致了去年底以来的COVID-19大流行。两种病毒均被认为起源于蝙蝠，同时必须通过直接或间接的种间传播，才能引起大流行。

受体利用是决定病毒宿主范围的关键因素，而宿主范围又是病毒种间传播的关键。来自中国的最新研究以受体为切入口，发现新冠病毒中间宿主范围比SARS窄。鸡、小鼠概率低；而穿山甲同样概率不高，因为穿山甲冠状病毒对ACE2的利用率更接近SARS-CoV，而非SARS-CoV-2；三文鱼这类鱼类和爬行类动物，则不可能是中间宿主。

近日，湖南大学生物学院的研究团队在生物领域预印本平台bioRxiv上发表了一篇论文，题为“Receptor utilization of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) indicates a narrower host range of SARS-CoV-2 than that of SARS-CoV”。该论文通讯作者为湖南大学生物学院病原生物学与免疫学研究所教授葛行义。

血管紧张素转换酶2 (ACE2)是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体，但只有某些动物的ACE2可以被病毒利用。这项研究中，研究团队利用假病毒进入细胞实验来评估这两种病毒对20种动物ACE2受体的利用能力。研究发现SARS-CoV-2比SARS-CoV使用的动物ACE2种类更少，表明SARS-CoV-2的宿主范围更窄。与此同时，另一种SARS相关冠状病毒——穿山甲冠状病毒，其基因组与SARS-CoV-2高度同源，但其ACE2的利用情况与SARS-CoV相似，而非与SARS-CoV-2相似。

为了阐明受体利用机制，研究团队比较了20中动物ACE2的氨基酸序列，发现了5个可能对ACE2利用至关重要的氨基酸残基，包括可能决定SARS-CoV、SARS-CoV-2和穿山甲冠状病毒不同受体利用的第20和42个氨基酸N端。

研究者们提到，该研究促进了对大流行冠状病毒受体利用的理解，可能有助于对致病性冠状病毒的病毒追踪、中间宿主筛选和疫情防控。

跨物种传播是导致高致病性冠状病毒流行的主要原因，如SARS-CoV和SARS-CoV-2。此前的病毒追踪研究表明，中华菊头蝠是SARS-CoV的天然宿主，最近的系统发育分析显示，SARS-CoV-2可能也起源于蝙蝠相关SARS病毒。一些小型哺乳动物，如果子狸和浣熊，可能是SARS-CoV的中间宿主，并可能是2003年初SARS流行的直接来源，因为这些动物体内能够成功分离出SARS- CoV。同样，在马来穿山甲中也发现了类似SARS-CoV-2的病毒，这表明穿山甲或许是SARS-CoV-2的中间宿主。

中间宿主动物在天然病毒宿主向人类传播时发挥重要作用，而病毒的宿主范围是决定中间宿主的重要因素。决定病毒宿主范围的一个主要因素是：病毒与宿主细胞上受体之间的识别、结合。SARS-CoV和SARS-CoV-2都利用血管紧张素转换酶2 (ACE2)作为细胞受体。

ACE2于2000年被发现，最初被认为一种表达于心脏和肾脏血管内皮细胞的外肽酶，可催化血管紧张素的转化。ACE2高度保守，在大多数脊椎动物中广泛表达，但并不是所有的ACE2都能作为SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体。例如，SARS-CoV可以使用小鼠的ACE2作为受体，而SARS-CoV-2不能，这表明小鼠是SARS-CoV的潜在宿主，而不是SARS-CoV-2的潜在宿主。

研究者之前的研究预测了SARS-CoV-2对ACE2的利用，表明SARS-CoV-2可以利用除小鼠ACE2s和部分鸟类ACE2s之外的大多数哺乳动物ACE2s。同时，研究者还预测了ACE2中9个对SARS-CoV-2利用至关重要的氨基酸残基。

在这项研究中，研究者在天然缺乏ACE2表达的HeLa细胞中体外表达了20种不同动物的ACE2。然后用带有冠状病毒刺突蛋白的假病毒颗粒感染细胞，检测其对ACE2的利用。结果表明，SARS-CoV和SARS-CoV-2都可以利用大多数哺乳动物的ACE2作为受体，而鱼类和爬行动物则不能。

有趣的是，与小鼠ACE2相似，SARS-CoV可以使用鸡的ACE2，而SARS-CoV-2不行，这表明SARS-CoV-2的宿主范围较窄，特别是在小鼠和鸟类中。研究者还测试了穿山甲冠状病毒假病毒，其与SARS-CoV-2具有高度相似的刺突结构。令研究者惊讶的是，穿山甲冠状病毒的ACE2利用率与SARS-CoV相似，但与SARS-CoV-2并不相似。

通过对20个ACE2氨基酸序列比对，研究者进一步确认了氨基酸残基T20、K31、Q42、Y83等对SARS-CoV-2利用ACE2受体至关重要，而Y41、K68等关键的氨基酸残基则不是。尤其是ACE2的T20氨基酸残基可能通过与S477和T478在SARS-CoV-2 spike蛋白的受体结合基序(RBM)内相互作用，在刺突蛋白-ACE2结合中发挥了关键作用。但ACE2与SARS-CoV和穿山甲冠状病毒刺突的结合并不是必需的。这些氨基酸残基可能部分决定了SARS-CoV-2独特的受体利用和宿主范围。

综上所述，这项研究为SARS-CoV-2利用ACE2ti供了更清晰的认识，这可能有助于更好地理解病毒-受体相互作用和SARS-CoV-2的宿主范围。

假病毒制备和ACE2表达的验证

在该研究中，研究者调查了三种SARS相关病毒对ACE2的利用，包括SARS-CoV-BJ01、SARS-CoV-2和穿山甲冠状病毒。由于穿山甲被怀疑是SARS-CoV-2的潜在中间宿主，研究者对穿山甲冠状病毒进行了测试。值得注意的是，除了498个氨基酸残基外，穿山甲冠状病毒刺突蛋白的受体结合基序(RBM)与SARS-CoV-2 刺突蛋白几乎相同，但在多个氨基酸位点上与SARS-CoV 冠状病毒不同。

为了验证三种假病毒制备成功，取病毒后裂解用于病毒包装的HEK293T细胞，裂解细胞后进行Western blot检测ha标记的刺突蛋白。三种包装细胞的样品均显示出典型的SARS

相关刺突蛋白条带(约180 kDa)，说明假病毒制备成功。

然后，研究者继续验证来自不同动物的20个ACE2s在HeLa细胞中的表达。研究者用含有不同动物ACE2编码基因的质粒转染HeLa细胞。转染48 小时后可以观察到所有ACE2条带(约150 kDa)，说明所有ACE2s在HeLa细胞中均成功表达。

SARS-CoV和SARS-CoV-2对ACE2利用的差异

研究者分别用20个表达不同ACE2的质粒或空载体转染HeLa细胞，作为对照。转染48小时后，细胞被SARS-CoV-BJ01、SARS-CoV-2或穿山甲冠状病毒假病毒感染。感染48小时后，裂解细胞并进行荧光素酶检测，以评估不同ACE2介导的伪病毒进入细胞的效率。

如果空载体转染并感染三种假病毒中的任一种的HeLa细胞的样品中均未观察到发光信号，则说明没有ACE2的天然HeLa不能介导假病毒的进入。在表达甲壳类、鳄鱼或蝰蛇ACE2的细胞的荧光信号很低，这表明鱼和爬行类ACE2几乎不能介导假病毒的进入。当鸡或小鼠表达ACE2的被SARS-CoV-BJ01假病毒感染而非SARS-CoV-2假病毒感染时，表达ACE2的细胞表现出较强的发光信号，这说明SARS-CoV-BJ01可以利用鸡或小鼠的ACE2进入细胞，而SARS-CoV-2不能。穿山甲冠状病毒对鸡和小鼠的ACE2均有利用能力，但其对鸡ACE2的利用效率远低于SARS-CoV-BJ01。相反，在表达蝙蝠ACE2的细胞中，SARS-CoV-2伪病毒比SARS-CoV-BJ01或穿山甲冠状病毒伪病毒激发的荧光更强，这表明SARS-CoV-2对蝙蝠ACE2的利用能力最强。对于其他的ACE2s，三种假病毒的感染都产生了强的发光信号，这说明三种SARSr-CoV都能够利用广泛的ACE2s。

SARS-CoV-2利用的ACE2s受体和关键氨基酸的系统发育分析

为了评价上述20个ACE2的系统发育关系，研究团队基于所有ACE2的氨基酸序列构建了一个系统发育树。

他们观察到明显的哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类分支。而哺乳动物ACE2中，没有与SARS-CoV-BJ01或SARS-CoV-2假病毒利用的ACE2相对应的显著分支，这说明整个序列分析很难揭示病毒利用受体的关键因素。

在研究团队之前的研究中，基于SARS-CoV-2对人、蝙蝠、果子狸、猪和小鼠ACE2s的利用，他们预测了人类ACE2上9个可能对受体利用至关重要的氨基酸位点，包括T20、K31、Y41、K68、Y83、K353、D355、R357和M383。

在这项研究中，研究团队测试了另外15个物种，然后检查了20个ACE2的9个位点，以验证这9个位点在SARS-CoV-2利用中的作用。

如图3A所示，Y/H41、D355、R357和R383在所有ACE2s中保守，说明这些位点并不能决定SARS-CoV-2对受体的利用。同样，K68在小鼠和鸡的ACE2s中均保存，不能被SARS-CoV-2使用，可能对SARS-CoV-2的利用也不重要。Q42在小鼠ACE2中保守，在鸡ACE2中被E42替代，其在SARS-CoV-2中的作用可能复杂。相比之下，研究团队发现，可用ACE2s中的T20、K31和Y83与不可用ACE2s中的氨基酸不同，说明它们在SARS-CoV-2利用方面起着决定性作用。

不过，研究团队同样提到研究尚有局限性，其主要基于氨基酸分析，缺乏实验证据，难以明确SARS-CoV-2的宿主范围。