MicroRNA-34a Suppresses Autophagy in Alveolar Type II Epithelial Cells in Acute Lung Injury by Inhibiting FoxO3 Expression

MicroRNA-34a通过抑制FoxO3表达抑制急性肺损伤肺泡II型上皮细胞自噬

摘要

肺泡II型上皮细胞（AT-II）过度自噬是急性肺损伤（ALI）的主要原因之一。然而，潜在的分子机制尚待确定。microRNA（miRNA）与许多疾病中的自噬有关。因此，本研究的目的是研究ALI发病机理中miRNA表达与AT-II细胞自噬活性之间的关系及其分子机制。用脂多糖（LPS）在体内和体外诱导小鼠ALI和AT-II细胞损伤，并测定miR-34a和自噬相关蛋白LC3 II / I和p62的表达。而且，在miR-34a过表达和抑制后研究了自噬活性。还确定了miR-34a对其靶基因FoxO3调节AT-II细胞自噬活性的作用。 LPS诱导自噬活性并增加miR-34a在肺组织和AT-II细胞中的表达。体外结果显示，miR-34a的上调被抑制，而miR-34a的抑制则促进了AT-II细胞的自噬。此外，miR-34a可以直接与自噬相关基因FoxO3的3-非翻译区结合，以降低其表达。此外，FoxO3表达的敲低抑制了AT-II细胞的自噬活性。总之，这项研究表明，miR-34a可能通过靶向FoxO3来减少LPS诱导的ALI的损伤，从而抑制AT-II细胞中过度的自噬活性。

关键词: acute lung injury; alveolar type II epithelial cells; autophagy; miR-34a; FoxO3.

引言

自噬是进化上保守的溶酶体降解途径[14，15]。在各种不同的模型中，它都具有保护性和破坏性，表明其在人类疾病中的作用很复杂。大量证据显示自噬和选择性自噬在细胞存活，细胞死亡以及与复杂性肺病发病机制相关的免疫和炎症反应中的作用[14]。以前的研究报道，自噬是对各种伤害的诱导反应，例如香烟烟雾，氧化应激以及用TNF-α或脂多糖（LPS）进行治疗，并且不同类型的细胞自噬可能对急性肺损伤有保护性或不利影响（ALI）[7]。越来越多的证据表明，II型肺泡上皮细胞的过度自噬活性在ALI中起重要的致病作用[7，20]，其抑制作用优于ALI [7，14]。

Lo等。报告指出，盲肠结扎和穿刺（CLP）引起的化脓性肺部自噬代表保护性反应[12]。但是，由于吞噬体在II型肺泡上皮细胞中的过度自噬积累，自噬在败血症的晚期可能会导致适应不良，从而导致ALI。两项研究[13，19]独立报告，II型肺泡上皮细胞过度自噬可能导致H5N1流感患者发生ARDS（急性呼吸窘迫综合征）。抑制自噬可以作为治疗H5N1感染的一种新策略，研究表明自噬阻断剂（例如beclin1和3-甲基腺嘌呤）可能有助于降低H5N1病毒感染期间ALI的发生率[ 17、19]。先前的研究[9，10]也报道了吸入纳米材料，包括星爆型聚酰胺基胺树枝状大分子（PAMAM）和COOH-CNT（功能化的单壁碳纳米管），是通过在体内释放Akt-TSC2-mTOR信号通路来诱导ALI的。其他体外研究报告称，用PAMAMor COOH-CNT处理可导致II型肺泡上皮细胞中自噬体聚集。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤挽救了纳米颗粒诱导的过度自噬并改善了小鼠的ALI。烟尘暴露也会引起ALI，烟尘暴露会导致II型肺泡上皮细胞过度自噬[2]。

肺泡II型上皮细胞的过度自噬活性可能导致炎症因子分泌增加，细胞死亡和各种功能障碍，从而导致ALI恶化。自噬抑制剂可以降低II型肺泡上皮细胞的自噬活性，并可以抑制ALI的发展。因此，重要的是研究ALI过程中II型肺泡上皮细胞的自噬调节机制。

MicroRNA是小的非编码RNA，它们通过与各种靶mRNA的3'-UTR结合来负调控基因表达，从而促进mRNA降解或抑制翻译。最近，确定ALI / ARDS发病机理遗传成分的研究已经调查了miRNA在此过程中的参与。microRNA-34a（miR-34a）是一种多功能调节剂，参与细胞增殖，凋亡，生长和自噬。据报道，在急性kindey损伤期间，miR-34a抑制了血管紧张素II治疗的心肌细胞[8]和kindey小管上皮细胞的自噬活性。miR-34a在哺乳动物的heart和肺部发育中起重要作用。据报道，新生肺中的miR-34a表达显着增加，这是由于缺氧[1]，博来霉素诱导的肺纤维化[22]和葡萄球菌肠毒素B诱导的ALI [18]。先前的研究还报道了miR-34a通过直接抑制ATG9A和ATG4B的表达来调节自噬活性[8，24]。

在这项研究中，我们表征了miR-34a在LP诱导的ALI小鼠肺组织和II型肺泡上皮细胞中的表达，并研究了miR-34a对ALI中II型肺泡上皮细胞自噬的影响。结果数据显示，miR-34a靶向FoxO3 mRNA的3'-UTR序列并调节其表达，表明miR-34a可能通过靶向FoxO3抑制II型肺泡上皮细胞自噬。

材料和方法

动物与ALI模型

从湖南中医药大学实验动物中心购买的健康雄性C57BL / 6小鼠，年龄8-10周，体重17.6-25.4 g（长沙），用于实验，并在实验前适应3天。给动物随意喂食啮齿动物食物和水，并随机分为不同的组：ALI组，气管内滴注3 mg / kg LPS（大肠杆菌0111：B4，Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国）和对照组本组气管内滴入等体积的生理盐水。通过腹膜内注射10％水合氯醛麻醉小鼠（中国青岛青岛玉龙藻类有限公司），并保持仰卧姿势，同时监测自然呼吸。ALI组的小鼠在受伤后的指定时间（6、12、24 h）处死，而对照组的小鼠在气管内滴入生理盐水后24 h处死。实验方案完成后，可以快速获得动物的肺组织（每个时间点n = 6）。通过肺的病理检查证实了ALI的诱导。

肺组织病理学

尸检时，切除左肺并用4％多聚甲醛固定24 h，然后用梯度酒精将肺组织脱水并在52℃下包埋在石蜡中。制备切片并用苏木精和伊红染色。为了评估肺损伤的严重程度，两名病理学家使用Nishina等人的方法（未指定）盲目地为每个肺部分配了肺损伤评分（LIS）。 [16]。简要地，评估肺组织切片的肺泡充盈，出血，空域或血管壁中嗜中性粒细胞的浸润或聚集，以及肺泡壁/透明膜的厚度。肺损伤程度评分为：0，最小； 0。 1，轻度； 2，适中； 3，严重；和4，最大伤害。对于每只动物，随机选择六个高放大倍率场进行分级，并计算平均LIS得分。

鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及细胞损伤的诱导

按照Corti等[3]所述的方法，从6周龄的小鼠中分离出纯度为90-95％的II型肺泡上皮细胞。简而言之，杀死小鼠，给肺动脉插管，并用生理盐水原位灌注肺以冲洗血液。气管插管，并向肺中注入2 ml分散酶II（5 U / ml，在PBS中； Becton-Dickinson，加利福尼亚州圣何塞），然后注入0.3 ml温热的低熔点琼脂糖（在PBS中为1％），防止分离Clara细胞和上呼吸道上皮细胞。在冰上冷却肺，将其解剖，用盐水冲洗，然后放入5 ml分散酶中，在室温下轻轻摇动消化60分钟。在孵育的最后5分钟，添加胰DNA酶（在DMEM中为0.01％； Sigma-Aldrich）。挑逗肺组织，并将所得细胞悬液依次通过100-，40-和21-μm无菌尼龙网过滤。通过在37℃下淘选鼠多克隆抗鼠CD45和抗鼠CD16 / CD32抗体（均为Becton-Dickinson抗体）淘洗白细胞，以去除白细胞。收集非贴壁细胞，通过离心沉淀，重悬于生理盐水中，并使用血细胞计数器计数。分离的AT-II细胞制备物的纯度通过在修饰的Papanicolaou染色的细胞纺丝中层状体的可视化来确定。对于温育实验，用LPS（1μg/ ml）诱导II型肺泡上皮细胞。选择的LPS剂量与以前的报告和我们的先导研究一致[23]。

miR-34a模拟物或抑制剂的转染

MiR-34a模拟物或miR-34a抑制剂及其阴性对照寡核苷酸购自GenePharma（中国上海）。根据制造商供给的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，California，USA）进行转染。简而言之，将约5×100000个细胞接种到装有5ml适当的完全生长培养基的烧瓶中，并在37℃下与5％CO 2一起温育直至细胞汇合至70-80％（24小时）。用无血清，无抗生素的培养基冲洗后，将细胞用miR-34a模拟物或miR-34a抑制剂及其阴性对照寡核苷酸在20μL脂质转染胺中转染，然后在37°C的CO2培养箱中培养6 h 。在分析之前，将转染的细胞重悬并在常规培养基中培养48-72小时，然后用LPS（1μg/ ml）处理细胞以诱导损伤。

siRNA转染

FoxO3 siRNA和对照siRNA购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利市）。将约5 104个细胞接种到24孔微孔板的每个孔中，并生长24小时以达到30-50％的融合度。然后根据制造商的说明，将siRNA和Lipofectamine 2000（Invitrogen）的混合物在100μl无血清的Opti-MEM中孵育。 4-6小时后可能需要更换培养基。在二氧化碳培养箱中于37℃孵育细胞48小时。使用实时聚合酶链反应（RTPCR）和Western blotting检测FoxO3的表达。

RNA提取和RT-PCR

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。然后使用第一链合成试剂盒（Invitrogen）将五微克总RNA用作模板来合成cDNA。然后，使用SYBR Green染料，使用TaqMan系统（ABI-Prism 7700序列检测系统，Biosystems，贝塞斯达，马里兰，美国）将来自该合成的cDNA用于定量RT-PCR分析。使用了以下引物对：小鼠FoxO3； 正向5'-GTGGACCGACTTCCGCTCGC-3'和反向5'-GCTTGCCAGGATGGGCGACA-3'； 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）; 正向5'-TGGTATCGTGGAAGGACTC-3'和反向5'-AGTAGAGGCAGGGATGATG-3'。通过测量候选基因与对照基因GAPDH之间的平均循环阈值（Ct）比率对RTPCR数据进行标准化。公式2Ct（候选）/ 2Ct（对照）用于计算归一化比率。

TaqMan RT-PCR用于miRNA定量

使用Trizol（Invitrogen）从冷冻的肺组织和细胞系中分离总RNA，然后使用Taqman microRNA逆转录试剂盒进行逆转录，并根据制造商的说明使用TaqMan microRNA分析试剂盒（Biosystems）进行RT-PCR。使用Stratagene Mx3000仪器一式三份进行反应，并将miRNA表达标准化为U6。

蛋白质印迹分析

分离蛋白质并通过12％SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上（Schleicher； Schuell，德国）。将膜在含有10％脱脂奶粉和0.5％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中封闭过夜，然后与一抗孵育2小时。辣根过氧化物酶结合的IgG用作第二抗体。使用二氨基联苯胺（DAB； Boster Biological Technology，武汉，中国）观察免疫反应带，并将蛋白质表达标准化至GAPDH。使用了以下抗体：兔多克隆抗LC3B抗体（1：1000； Novus Biologicals，Littleton，科罗拉多州，美国），抗p62单克隆抗体（BD Transduction Laboratories，Lake Franklin，新泽西州，美国），兔抗FoxO3多克隆抗体抗体（Abcam，英国剑桥科学园），山羊GAPDH单克隆抗体（Sigma），结合HRP的抗山羊蛋白和抗兔IgG（Boster Biological Technology）。

质粒载体的构建

为了确定miR-34a是否直接与FoxO3的3'-UTR结合，我们利用了3'-UTR荧光素酶报告基因检测。使用以下引物通过PCR扩增FoxO3 3'-UTR的443个核苷酸的序列（包括miR-34a的结合位点）：正向，5'-ACACAAGCTTCTTATCTTGTATTTCCAT-3'和反向，5'-ACACGAGCTCAGCTGTGAACACCAAC CC- 3'并插入到pLuc荧光素酶载体（Ambion，Austen，Texas，USA）中的荧光素酶基因的下游。使用QuickChange诱变试剂盒（Stratagene，Heidelberg，Germany）对FoxO3 3'-UTR处的miR-34a目标位点进行定点诱变。对所得的构建体进行测序，并将其命名为pLuc-FoxA1-wt或pLuc-FoxA1-mut。

萤光素酶测定

为了进行报告基因检测，将指数生长的II型肺泡上皮细胞培养在24孔板中，并用Lipofectamine用100 ng pLuc-FoxO3-wt或pLuc-FoxO3-mut和50 nM miR-34a模拟物或miR-34a抑制剂转染。 2000（Invitrogen）。转染后四十八小时，收获细胞，并根据制造商的说明用Dual-Luciferase Reporter测定试剂盒（Promega，Madison，Wisconsin，USA）进行测定。从至少三个独立实验中一式三份进行所有转染。

统计分析

图中和文字中的数据表示为平均值±平均值的标准误（SEM）。每个实验至少进行3次，并使用单向方差分析进行统计分析。否则，将显示代表性数据。P <0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

LPS诱导小鼠ALI

LPS诱导小鼠肺组织和肺泡II型上皮细胞自噬和miR-34a表达

图1 脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠和II型肺泡上皮细胞的肺组织中肺组织学评分，自噬和miR-34a表达的变化。a不同组肺组织学评分的变化。b通过Western印迹法检测LPS诱导的ALI模型的肺组织或LPS诱导的小鼠II型肺泡上皮细胞中自噬相关蛋白的表达水平（c）（d）测定miR-34a的水平 LPS诱导的ALI模型的肺组织或LPS诱导的小鼠II型肺泡上皮细胞中的实时聚合酶链反应检测（e）。确定所有结果的相对值，并表示为重复进行的三个实验的平均值的平均标准误差。*与对照组相比有统计学意义的差异（Ctrl），p <0.05。

miR-34a调节小鼠肺泡II型上皮细胞的自噬

图2 miR-34a抑制了II型小鼠肺泡上皮细胞的自噬活性。在用miR-34a模拟物，miR-34a抑制剂或阴性对照转染II型肺泡上皮细胞后48小时，进行Taqman实时定量聚合酶链反应分析以评估miR-34a的表达。b用miR-34a模拟物，miR-34a抑制剂或阴性对照转染48小时后，将LPS肺泡II型上皮细胞与LPS孵育，并通过蛋白质印迹分析确定自噬相关蛋白的表达。所有结果的相对值表示为重复进行的三个实验的平均值的平均值±标准误差。 *与阴性对照相比，具有统计学意义的差异，p <0.05。

miR-34a直接靶向小鼠肺泡II型上皮细胞中的FoxO3

图3 miR-34a抑制了II型鼠肺泡上皮细胞中FoxO3蛋白的表达。用miR-34a模拟物，miR-34a抑制剂或阴性对照转染II型肺泡上皮细胞后48小时，进行Taqman实时定量聚合酶链反应或Western印迹分析以评估FoxO3 mRNA（a） 和蛋白质（b）的表达。*与阴性对照相比有统计学意义的差异，p <0.05。（c）用miR-34a模拟物或miR-34a抑制剂和pLu-FoxO3共转染II型肺泡上皮细胞。48小时后，进行荧光素酶活性。该值表示为相对于海kindey荧光素酶活性标准化后的相对荧光素酶活性。确定所有结果的相对值，并表示为重复进行的三个实验的平均值±SEM。

FoxO3的下调抑制了小鼠肺泡II型上皮细胞的自噬活性

图4 当FoxO3被siRNA抑制时，自噬抑制了II型鼠肺泡上皮细胞。a，b用对照siRNA或FoxO3 siRNA转染48小时后，使用实时聚合酶链反应或Western印迹分析鼠II型肺泡上皮细胞中的FoxO3mRNA和蛋白表达。c用对照siRNA或FoxO3 siRNA转染48小时后，将II型肺泡上皮细胞与脂多糖一起孵育，并通过蛋白质印迹分析确定自噬相关蛋白的表达。*与对照组相比，具有统计学意义的差异，p <0.05。

讨论

自噬的作用涉及通过消除细胞中受损的蛋白质和细胞器来维持正常细胞和组织的体内平衡。

但是，自噬过多或不足可导致疾病发病。在H5N1流感，CLP或纳米材料颗粒诱导的ALI阶段，以往的研究报告称肺泡II型上皮细胞自噬被过度激活[12、13、17、19]。进一步的研究证实，肺泡II型上皮细胞的过度自噬激活是ALI恶化的关键特征。本研究表明，LP3诱导的LP诱导的ALI小鼠和LPS诱导的II型肺泡上皮细胞的肺组织中LC3 II / I的比例增加，而p62的水平降低，从而模拟了ALI期间肺泡II型上皮细胞的损伤。这表明在LPS诱导的ALI中，小鼠II型肺泡上皮细胞的自噬活性也增加了。

在了解miRNA（包括miR-34a）在自噬中的作用方面已经取得了重大进展[5]。miR-101抑制MCF-7细胞系中的自噬[6]，而miRNA-212 / 132家族调节心肌细胞的自噬[21]。在急性kindey损伤中，miR-34a通过抑制kindey小管上皮细胞中的ATG4B抑制自噬[11]。另一项研究报道，miR-34a通过抑制ATG9A表达和自噬活性，在调节Ang II诱导的心肌肥大中起重要作用[8]。先前的研究还报道了miR-34a也参与多种肺部疾病，并且可以调节特发性肺纤维化患者的II型肺泡上皮细胞的衰老[4]。我们的研究表明，LPS诱导的小鼠肺组织和II型肺泡上皮细胞中miR-34a明显上调。此外，miR-34a模拟物过度表达miR-34a抑制了LPS诱导的II型肺泡上皮细胞的自噬，但是miR-34a抑制剂抑制miR-34a的表达显着增加了LPS诱导的肺泡类型的自噬。 II上皮细胞。这些结果表明，抑制II型肺泡上皮细胞的过度自噬活性是增加miR-34a表达并保护ALI的机制。但是，关于ALI期间miR-34a降低II型肺泡上皮细胞自噬活性的机制仍知之甚少。

生物信息学分析表明，自噬相关基因FoxO3是miR- 34a的候选靶标。因此，我们预测miR-34a通过调节FoxO3表达来调节II型肺泡上皮细胞的自噬。因此，进一步探讨了涉及miR-34a和FoxO3的调控机制的可能性。分离小鼠的II型肺泡上皮细胞并与LPS温育以模拟ALI中的II型肺泡上皮细胞损伤，然后用miR-34a模拟物或miR-34a抑制剂转染。与II型肺泡上皮细胞阴性对照相比，用miR-34a模拟物治疗后FoxO3表达明显降低，而用miR-34a抑制剂治疗后FoxO3表达显着增加。萤光素酶报告基因测定随后用于表征miR-34a作为ALI期间FoxO3表达调节剂的机制。结果表明，miR-34a通过与3'-UTR区结合来抑制FoxO3蛋白表达。因此，我们得出结论，FoxO3是miR-34a的靶基因。我们还将FoxO3 siRNA转染到II型肺泡上皮细胞中，以显示当将II型肺泡上皮细胞与LPS孵育时，FoxO3 siRNA处理显着降低了自噬活性。

miR-34a会抑制自噬，这可能对疾病的发生有利或不利，具体取决于疾病。但是，在ALI和II型肺泡上皮细胞中尚未报道miR-34a及其靶标的功能。自噬对ALI可能有害或有益。适度的自噬可保护细胞免受各种伤害。然而，过度自噬，特别是对于II型肺泡上皮细胞，在ALI中起重要的致病作用，其抑制作用可能阻止ALI [7，14，20]。在本研究中，在LPS诱导的ALI模型和LPS诱导的肺泡II型肺泡上皮细胞中，肺组织的自噬活性增加，这些肺泡II型肺泡上皮细胞在ALI期间受到损伤。miR-34a在ALI中上调，从而抑制LPS诱导的ALI期间肺泡II型上皮细胞损伤的自噬。此外，结果显示，自噬相关基因FoxO3的靶向涉及miR-34a，而FoxO3表达的沉默可抑制LPS诱导自噬。

总之，这项研究供给了第一个证据，证明miR-34a通过抑制FoxO3表达来抑制LPS诱导的ALI期间II型肺泡上皮细胞的自噬活性。由于肺泡II型上皮细胞过度自噬活性在ALI的病理过程中的重要作用，我们预测miR-34a的诱导是一种保护因子，可以用作治疗ALI的新型治疗方法。因此，我们提出LPS诱导的ALI中肺泡II型上皮细胞的自噬活性和miR-34a的表达增加。miR-34a可以通过抑制FoxO3表达来抑制II型肺泡上皮细胞这种过度的自噬活性，从而导致针对ALI的保护。

鸣谢

利益冲突

参考文献：详见原文。

• 文献泛读 miRNA 文献.pdf(1210.48k)