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细胞学与信号转导

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m6A reader IGF2BP1 and tumorigenesis

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今天起未来一周开一个小专题,关于增殖的实验方法及结果解读专题。

癌肽调节m6A阅读器IGF2BP1对m6A的识别和肿瘤发生

摘要:N6-甲基腺苷(m6A)是真核RNA中最普遍的修饰。m6A的生物学重要性取决于控制mRNA命运和功能的m6A阅读器。但是,尚不清楚m6A阅读器的其他调控亚基是否参与RNA的m6A识别。在这里,我们发现长非编码RNA(lncRNA)LINC00266-1编码71个氨基酸的肽。该肽主要与RNA结合蛋白(包括m6A阅读器IGF2BP1)相互作用,因此被称为RNA结合调节肽(RBRP)。RBRP与IGF2BP1结合并增强IGF2BP1对RNA(例如c-Myc mRNA)的m6A识别,从而增加mRNA的稳定性和c-Myc的表达,从而促进肿瘤发生。RBRPhigh高的癌症患者预后较差。因此,由LINC00266-1编码的肽肽RBRP是m6A阅读器的调节亚基,并增强了m6A阅读器对目标RNA的m6A识别,从而发挥其致癌功能。

N6-甲基腺苷(m6A)是真核RNA的最普遍修饰。 RNA m6A甲基化由RNA甲基转移酶METTL3和METTL14以及脱甲基酶F6和ALKBH5可逆地动态调节,即METTL3和METTL14。RNA m6A修饰的生物学重要性依赖于m6A结合蛋白(即m6A读码器),其直接指导独特的生物学功能[1,2]。一组包含YT521-B同源(YTH)域的蛋白质,包括YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1和YTHDC2;包含IGF-2 mRNA的蛋白质,包括IGF2BP1,IGF2BP2和IGF2BP3;以及异质核糖核蛋白hnRNPA2B1 hnRNPC和hnRNPC已被确认为可通过调节mRNA稳定性,翻译,剪接,结构,衰变和亚细胞定位来控制mRNA命运的m6A RNA阅读器[4-8]。最近,发现m6A甲基转移酶的其他一些调控亚基,包括WTAP,VIRMA,ZC3H13,HAKAI和RBM15 / 15B,在m6A在RNA上的安装中起着重要作用[1,9-12]。但是,m6A RNA阅读器和m6A脱甲基酶的调节亚基仍未开发。

长非编码RNA(lncRNA)占哺乳动物非编码转录本的最大比例。 LncRNA定义为不包含蛋白质编码开放阅读框(ORF)的200多个核苷酸的转录本。 ENCODE项目证明,人类基因组包含28,000多种不同的lncRNA转录本[13]。通过调节基因转录(顺式或反式),染色质重塑和mRNA剪接,LncRNA被鉴定为细胞中的重要因子。产生内源性小干扰RNA(siRNA)和微小RNA前体;改变蛋白质的定位;调节蛋白质活性;和组织蛋白质成分[14,15]。lncRNA的失调与癌症和癌症患者的生存时间有关[16-18]。然而,lncRNAs是否参与调控RNA上m6A的安装,去除或识别尚待探索。

在这项研究中,我们发现LINC00266-1(以前在智人中作为lncRNA注释,其功能未知)实际上编码71个氨基酸(aa)肽。该肽主要与RNA结合蛋白相互作用,包括m6A阅读器IGF2BP1。因此,我们称其为肽RNA结合调节肽(RBRP)。 RBRP与m6A阅读器IGF2BP1结合,并通过增强RNA稳定剂HuR,MATK3和PABPC1的募集,在c-Myc mRNA等RNA上促进IGF2BP1对m6A的识别,从而提高c-Myc mRNA的稳定性和水平。 RBRP肽肽而非lncRNA LINC00266-1本身可通过增强m6A识别依赖性c-Myc mRNA稳定性来促进结直肠癌(CRC)的肿瘤发生。 LINC00266-1 lncRNA水平和RBRP肽水平在癌症组织中增加,并且分别是其在相应的相邻非肿瘤组织和亲本细胞系中的水平,是高度转移性的细胞亚系。 RBRP高肽水平的CRC患者比低水平的患者表现出更具侵略性的临床病理表型和较短的生存时间。总的来说,我们的发现表明,由未表征的lncRNA LINC00266-1编码的一种多肽,RBRP是m6A阅读器的另一个亚基,并调节m6A阅读器对靶RNA和肿瘤发生的m6A识别。

结果

鉴定具有编码潜力的lncRNA

具有编码潜能的lncRNA必须结合核糖体。分别对CRC SW480细胞和相应的转移性SW620细胞中核糖体结合的RNA进行测序。在这项研究中检查了鉴定出的lncRNA。在SW480和SW620细胞之间鉴定了384个差异表达≥1.2的核糖体结合的lncRNA差异表达(补充数据1)。

使用NCBI工具中的ORF Finder程序进一步分析了这384个与核糖体结合的lncRNA的编码潜力。发现了在SW480和SW620细胞之间差异表达的具有编码潜能的55个lncRNA(补充数据1)。选择了十个具有编码潜力的lncRNA的预测肽/蛋白质编码ORF,即LINC00263,KTN1-AS1,ZNF205-AS1,LOC100126784,LINC00266-1,LINC00115,LOC286467(FIRRE),FLJ20021,LOC728752和LOC284581。分别与起始密码子突变的GFP载体(GFPmut)的N末端融合。只有lncRNA LINC00266-1和FLJ20021的ORF能够被翻译;其他八个lncRNAs没有编码潜能(图1a)。在这里进一步研究了lncRNA LINC00266-1,并将在其他研究中研究FLJ20021。


图1 lncRNA LINC00266-1编码71-aa肽RBRP。将十个指定的lncRNA的ORF-GFPmut构建体转染到HeLa细胞中,并检测GFP荧光。 LOC *为LOC100126784,FIRRE也称为LOC286467。 比例尺:100μm。b,c将指定的构建体转染到HeLa细胞中48 h,用抗Flag和抗RBRP抗体检测RBRP-Flag融合肽的免疫染***),通过执行检测RBRP-Flag融合肽的水平 抗Flag和抗RBRP抗体的蛋白质印迹(c)。比例尺:10μm。 d使用质谱法鉴定了RBRP肽中的两个独特肽。 源数据作为源数据文件提供。

lncRNA LINC00266-1编码未鉴定的肽RBRP

lncRNA LINC00266-1先前被注释为智人(NR_040415)中的一种基因间lncRNA(lincRNA),其功能尚不清楚。我们观察到一个短的213个核苷酸的ORF,具有编码71-aa肽的潜力(补充图1)。我们称该肽为RBRP。序列比较未在任何其他物种中鉴定LINC00266-1或RBRP肽的同源物,并且RBRP中没有匹配的蛋白质和已知的结构域/基元,这表明RBRP是未鉴定的肽。

我们生成了一系列包含FOR和LINC00266-1的5'-非翻译区(5'-UTR)-ORF以及ATG突变的起始密码子构建体的Flag融合构建体,以确认其预测ORF的起始密码子lncRNA LINC00266-1是有活性的。在LINC00266-1 ORF-Flag(ORF)-和5'UTR-ORF-Flag(5'U)转染的细胞中观察到RBRP-Flag融合肽的大量表达,而起始密码子ATG(5' UTR-ORFmut-Flag,MT)取消了LINC00266-1中预测的ORF的翻译(图1b,c)。

我们生产了一种针对RBRP肽的抗体,以进一步检测和验证LINC00266-1 ORF在细胞中编码的RBRP肽。证实了针对RBRP肽的抗RBRP抗体的特异性(补充图2a,b)。在LINC00266-1 ORF和5'UTR-ORF转染的细胞中使用抗RBRP抗体进一步验证了RBRP-Flag融合肽,而LINC00266-1的ORF中ATG起始密码子的突变取消了对RPRP-Flag融合肽的检测。 RBRP融合肽(图1b,c)。集体地,RBRP融合肽被翻译成细胞。

最后,将LINC00266-1 ORF-GFPmut融合构建体转染到HEK293T细胞中,并使用抗绿色荧光蛋白(GFP)抗体免疫沉淀RBRP-GFP融合肽。使用质谱(MS)鉴定了RBRP肽中的两个独特肽片段(图1d)。总体而言,这些数据表明,先前被标注为lncRNA的LINC00266-1实际上编码71-aa肽。

RBRP肽是天然内源表达的,我们使用抗RBRP抗体检测了细胞RBRP肽,以验证细胞和组织中天然,内源性RBRP肽的存在和表达。我们开发的抗RBRP抗体可特异性检测天然内源性产生的RBRP肽(补充图2c-e)。天然的内源性RBRP肽已在结肠直肠癌,乳腺癌,卵巢癌和鼻咽癌细胞中得到验证(图2a,b)。此外,证实RBRP肽是在五对匹配的新鲜初级CRC组织及其对应的相邻非肿瘤结直肠组织中自然内源产生的(图2c)。最后,使用质谱分析法(补充图3)鉴定了天然,内源性RBRP肽中的三个独特肽片段,进一步表明天然,内源性RBRP肽存在于癌组织中。总而言之,RBRP是天然的,内源的,并且在各种细胞和组织中广泛表达。

在高度转移性癌细胞和原发性癌症中,LINC00266-1 lncRNA和RBRP肽的水平增加,根据我们与核糖体结合的RNA测序数据,与SW480细胞中的表达相比,CRC SW620细胞中LINC00266-1的表达上调。我们进一步证实,在高度转移性结直肠癌(SW620和HCT-116high),卵巢癌(SK-OV-3high和OVCAR-3high),鼻咽癌(S18)和乳房癌(MDA-MB-231high)中,LINC00266-1 lncRNA表达上调。癌细胞亚系与其亲代细胞系中的表达相比(补充图4a,b)。 LINC00266-1 lncRNA的水平在五对匹配的新鲜冷冻原代CRC组织及其相应的相邻非肿瘤结直肠组织中也增加了(补充图4c,d)。不幸的是,没有从公众可访问的数据集《癌症基因组图谱》和《 Oncomine》获得LINC00266-1表达数据。

与LINC00266-1 lncRNA水平相似,在高度转移性结直肠,卵巢,鼻咽和乳腺癌细胞亚系中,RBRP水平也比其亲本细胞系水平增加,并且在原发性CRC组织中,RBRP水平也升高。相应的非肿瘤性结直肠组织中的水平(图2b,c)。此外,使用带有抗RBRP抗体的免疫组织化学(IHC)对90对匹配的CRC组织和相应的大肠组织非肿瘤样品进行了广泛的组织微阵列分析(图2d)。与图2c中的结果相似,与相邻大肠组织非肿瘤样本中的RBRP水平相比,在CRC组织中观察到了较高的RBRP水平(图2e)。两者合计,与相应的亲代细胞系和非肿瘤组织相比,高度转移性癌细胞亚系和原发癌组织中LINC00266-1 lncRNA和RBRP肽的含量显着增加,这表明lncRNA LINC00266-1其编码的肽RBRP在肿瘤发生中起重要作用。


图2 LINC00266-1编码的RBRP肽是内源性和天然产生的,其上调与CRC患者的不良预后有关。a用抗RBRP抗体在SW480和SW620细胞中对RBRP肽进行免疫染色。比例尺:10μm。b在具有不同转移能力的指定癌细胞系中确定RBRP肽水平(低:低;高:高)。c在五对匹配的新鲜初级CRC组织(T)及其对应的相邻非肿瘤大肠组织(NT)中分析了RBRP肽的水平。d IHC在CRC组织(T)及其相应的邻近NT中为RBRP染色的代表性图像。e CRC组织(T)与相应的相邻NT之间的RBRP得分差异以带盒须的箱形图表示:5-95%(n = 90个组织样本)。曼·惠特尼(Mann Whitney)U检验。 f在CRC样本(n = 39个低RBRP的CRC组织样本和51个高RBRP的样本)中分析了RBRP水平与患者死亡百分比之间的关系。皮尔森的χ2检验。 g根据RBRP评分对CRC患者的生存情况进行Kaplan Meier分析。对数等级测试。 RBRP得分为0-3低,而得分为4-7高。源数据作为源数据文件提供。

RBRP肽高可作为CRC患者的独立预后因素。在90对匹配的CRC和相应的非肿瘤结直肠组织样本中,研究了RBRP水平与癌症患者临床病理特征之间的相关性。 RBRP水平升高与CRC的临床晚期呈正相关(p = 0.027;补充表1)。 Kaplan Meier生存分析显示,RBRP较高的CRC患者比RBRP较低的CRC患者死亡的风险更高(图2f,g; p = 0.000007,对数秩检验)。 CRC和RBRPlow高的患者的平均总生存期为45.3个月,而CRC和RBRPlow低的患者的平均生存期为67.1个月。此外,多因素Cox回归分析表明RBRPhigh是CRC患者生存不良的独立预后因素(危险比= 8.26,95%置信区间= 2.84-24.02,p = 0.000;补充表2)。总的来说,我们的结果表明,高RBRP水平与CRC患者的不良预后之间存在显着相关性,并且RBRP肽是CRC患者的独立预后因素。

敲低LINC00266-1抑制肿瘤发生。我们使用HCT-116和SW620细胞中的两种抗LINC00266-1 siRNA沉默LINC00266-1的表达,以研究LINC00266-1在CRC中的功能(补充图2c-e)。敲低LINC00266-1可抑制HCT-116和SW620 CRC细胞增殖,集落形成,迁移和侵袭(补充图5a-c)。因此,lncRNA LINC00266-1是肿瘤发生的驱动器。

LINC00266-1编码的RBRP肽促进肿瘤发生,但lncRNA LINC00266-1本身不促进。我们使用表达LINC00266-1短发夹RNA(shRNA)的慢病毒来靶向LINC00266-1 ORF的3'-UTR,以稳定地敲低LINC00266-1的表达。用LINC00266-1的稳定敲低构建了两种CRC细胞系HCT-116和SW480。在这些细胞中,我们恢复了ORF,5U或MT的表达,这些表达赋予了针对LINC00266-1的shRNA的抗性(图3a)。敲低LINC00266-1导致细胞生长,集落形成,迁移和侵袭显着降低,而这些改变在添加ORF表达后恢复到对照水平,但在LINC00266-1 MT表达后未恢复(图3b-d),表明RBRP肽可促进肿瘤发生,但lncRNA LINC00266-1本身不促进。

此外,我们将LINC00266-1 ORF(ORF),5'UTR-ORF(5'U)和5'UTR-ORFmut(mut)Flag融合构建体转染到两个CRC细胞系中,以分析LINC00266- 1-编码的RBRP肽和lncRNA LINC00266-1本身对癌症的进展。均产生RBRP肽的LINC00266-1 ORF和5个UTR-ORF构建体均促进CRC细胞增殖,集落形成,迁移和侵袭(补充图5d-f)。但是,LINC00266-1 5'UTR-ORFmut构建体不编码RBRP肽,不作为lncRNA起作用,它不会改变癌细胞的增殖,集落形成,迁移或侵袭。

稳定表达ORF和5'U的癌细胞衍生的异种移植物的体内生长显着增加,而LINC00266-1 MT构建体的异位稳定表达并未显着改变异种移植物的肿瘤生长(图3e)。另外,在小鼠尾静脉注射荧光素酶(Luc)标记的稳定表达ORF或5 U的癌细胞后,与注射阴性对照(NC)细胞的小鼠相比,在小鼠体内产生了更大的转移性结节。然而,注射稳定表达LINC00266-1 MT的细胞并没有显着改变小鼠体内形成的转移性结节(图3f,g)。集体地,由lncRNA LINC00266-1产生的RBRP肽而不是LINC00266-1 lncRNA本身,在体外和体内都促进了肿瘤的发生和转移,并且RBRP肽发挥了致癌作用。


图3 RBRP肽,但不是lncRNA LINC00266-1本身,在体外和体内都促进肿瘤发生和转移。a-d指示的LINC00266-1(266)ORF-Flag(ORF),5'UTR-ORF-Flag(5'U)和5'UTR-ORFmut-Flag(MT或mut)构建体,它们对用抗LINC00266-1 shRNA慢病毒(sh266)将LINC00266-1 shRNA转染到具有稳定的LINC00266-1表达的SW480和HCT-116细胞中;测定了RBRP水平(a),细胞生长(b)(n = 3个独立实验),菌落形成(c)(n = 3个独立实验)和迁移和侵袭(d)(n = 5个独立实验)。比例尺:50μm。e检查了稳定表达指定的LINC00266-1构建体的指定细胞系的体内肿瘤发生。左图和右图分别提供了异种移植肿瘤的图像和重量(每组n = 6只小鼠)。给NOD-SCID小鼠经尾静脉注射稳定表达指定的LINC00266-1构建体的Luc标记的HCT-116细胞(2 106个细胞/小鼠);移植后9周时可见荧光素酶活性(每组n = 5只小鼠)。分析了f中小鼠的荧光水平。除非另有说明,否则两尾不配对的学生t检验是b中的双向ANOVA。数据表示为均值SD。 * p <0.05,** p <0.01或*** p <0.001,ns表示无意义。源数据作为源数据文件提供。

RBRP与RNA m6A阅读器IGF2BP1相互作用。RBRP是一种未表征的肽,缺乏与其他蛋白质和域/基序的物种保守性和同源性。我们使用MS鉴定了与RBRP相互作用的蛋白质,以阐明RBRP促进肿瘤发生的机制。通过相互作用组学分析,鉴定了一百零七种潜在的RBRP相互作用物(图4a和补充数据2)。基因注释分析表明,这107种蛋白中有76种属于RNA结合蛋白。因此,我们将其称为LINC00266-1-编码肽RBRP。 RNA结合蛋白RNA m6A读取器IGF2BP1特别有趣,因为在已鉴定的RBRP相互作用因子中,IGF2BP1的蛋白质得分为TOP5,RNA m6A修饰在癌症标志中起重要作用,而IGF2BP1调节了重要的水平癌基因c-Myc和肿瘤发生[6,19,20],与RBRP在肿瘤发生中的致癌作用一致。因此,我们在这里选择IGF2BP1进行进一步研究。我们进一步证实,IGF2BP1存在于RBRP共免疫沉淀(共IPed)复合物中,而RBRP存在于IGF2BP1共IP复合物中,表明RBRP与IGF2BP1结合(图4b)。鉴于IGF2BP1与m6A修饰的RNA结合,我们进一步研究了RBRP与IGF2BP1的相互作用是否取决于RNA。我们发现在RNase A存在的情况下RBRP仍与IGF2BP1相互作用(图4c),这表明RBRP与IGF2BP1的结合不依赖RNA。

IGF2BP1蛋白由两个N端RNA识别域(RRM1​​和RRM2)和四个C端异质核糖核蛋白(hnRNP)K同源性(KH)域(KH1-4)组成[21]。我们生成了IGF2BP1-HA截短的融合构建体(图4d),并将这些构建体与ORF在HEK293T细胞中共表达,以研究哪些结构域与RBRP结合。我们发现RBRP结合到IGF2BP1的KH3 4双结构域(图4e,f)。先前的研究报道,KH3 4双结构域中的GxxG基序对于m6A识别和结合必不可少6。我们发现在KH3 4双结构域中将GxxG突变为GEEG完全消除了RBRP与IGF2BP1的相互作用(图4g,h)。进一步研究了RBRP与IGF2BP1结合的结构域或残基。 G19而非A的G19突变破坏了RBRP与IGF2BP1的结合(图4i,j),这表明RBRP中的G19残基对于IGF2BP1结合至关重要。总之,RBRP与RNA m6A阅读器IGF2BP1结合。


图4 RBRP与m6A阅读器IGF2BP1相互作用。a通过co-IP和质谱法鉴定了与RBRP相互作用的蛋白质。b,c将LINC00266-1 ORF-Flag(上图)和IGF2BP1-HA(下图)载体转染到HEK293T细胞中,将RBRP-Flag和IGF2BP1-HA复合物与抗Flag和抗HA抗体共IP在不存在(b)或存在(c)RNase A治疗的情况下,分别检测到IGF2BP1和RBRP / HA。d WT和IGF2BP1变异结构的不同结构域图。e,f将指示的IGF2BP1-HA突变体与LINC00266-1 ORF-Flag载体共转染到HEK293T细胞中; RBRP-Flag(e)和IGF2BP1-HA(f)复合物分别与抗Flag和抗HA抗体共IP。分别使用抗HA和抗Flag抗体检测了IGF2BP1-HA突变体和RBRP-Flag复合物。g,h将WT和GxxGΔ突变的IGF2BP1-HA载体转染到HEK293T细胞中,并测定RBRP与IGF2BP1GxxGΔ突变体的相互作用。i,j将WT或突变的RBRP-Flag构建体与IGF2BP1-HA质粒共转染到HEK293T细胞中,并确定RBRP突变体与IGF2BP1的相互作用。源数据作为源数据文件提供。

RBRP通过IGF2BP1促进肿瘤发生。正如预期的那样,IGF2BP1的沉默抑制了CRC细胞在HCT-116和SW480 CRC细胞中的增殖,集落形成,迁移和侵袭(补充图6),类似于由RBRP敲除诱导的癌症表型。为了研究RBRP是否通过IGF2BP1促进肿瘤发生,我们将细胞与ORF(编码RBRP)或ORFmut-Flag(MUT)(作为LNC00266-1 lncRNA)与抗IGF2BP1 siRNA共转染(补充图7a)。 IGF2BP1的敲低完全阻止了RBRP过表达诱导的细胞增殖,集落形成以及迁移和侵袭的增加(补充图7b-d),表明RBRP通过IGF2BP1促进了肿瘤的发生。

RBRP增强了m6A阅读器IGF2BP1对RNA的m6A识别。先前的研究表明,IGF2BP1是RNA m6A阅读器[6]。我们使用具有共有序列GG(m6A)CU(ss-m6A)的m6A甲基化的单链RNA寡核苷酸来研究RBRP对IGF2BP1对RNA识别m6A的影响。 RBRP而非LINC00266-1 lncRNA本身增强了IGF2BP1与m6A-RNA寡核苷酸的结合,而RBRP并未改变IGF2BP1与m6A-未甲基化的对照RNA(ss-A)的结合(补充图8a)。 IGF2BP1 KH3 4双结构域中的GxxG基序对于m6A识别和结合至关重要。当GxxG突变为GEEG(GxxGΔ)时,RBRP不会增加IGF2BP1与m6A-RNA的结合(补充图8b)。此外,RBRP中的G19突变为A19,但不与m6A阅读器IGF2BP1结合,这完全破坏了RBRP对增加内源性IGF2BP1与m6A甲基化RNA寡核苷酸结合的影响(补充图8c)。与内源性RBRP肽相似,重组RBRP肽段增强了重组IGF2BP1蛋白与m6A-甲基化RNA寡核苷酸的结合,而重组G19Amutated RBRP肽段则没有(补充图8d)。总的来说,RBRP增强了IGF2BP1对RNA的m6A识别。

先前的研究表明,IGF2BP1通过与编码区不稳定性决定簇(CRD)相关联来稳定c-Myc mRNA [20],而m6A-seq分析表明CRD带有m6A峰[6]。 C-Myc是最重要的致癌基因之一,与RBRP在肿瘤发生中的致癌作用一致。因此,c-Myc特别有趣,我们选择c-Myc进行系统研究。据报道,在c-Myc mRNA编码区的3'端约250 nt CRD对IGF2BP1结合至关重要,m6A-seq显示CRD区具有大量的m6A修饰[6]。根据先前的研究,合成了两个含有共有序列GG(m6A)CU(ss-m6A)(CRD1和CRD2)的CRD RNA寡核苷酸[6]。 RBRP而非LINC00266-1 lncRNA本身,增加了内源性IGF2BP1与m6A-甲基化的c-Myc CRD RNA寡核苷酸的结合,但并未改变IGF2BP1与m6Aun甲基化的c-Myc CRD RNA寡核苷酸的结合(图5a)。 RNA免疫沉淀(RIP)定量PCR(qPCR)分析进一步证实,RBRP而非LINC00266-1 lncRNA增强了细胞中内源性IGF2BP1与c-Myc CRD RNA的结合(图5b)。与内源性RBRP肽类似,重组RBRP肽段增加了重组IGF2BP1蛋白与m6A-甲基化的c-Myc mRNA CDR寡核苷酸的结合(图5f)。此外,当在细胞中过表达RBRP而不是LINC00266-1 lncRNA本身时,与IGF2BP1结合的RNA具有更多的RNA m6A修饰丰度(图5c)。当将IGF2BP1 KH3 4双结构域中的GxxG基序突变为GEEG(GxxGΔ)时,RBRP不会增加内源IGF2BP1对c-Myc的m6A修饰的mRNA CRD的识别(补充图9a,b)。这些数据表明RBRP增加了IGF2BP1与c-Myc的m6A修饰的mRNA CRD的结合。

此外,我们发现不与IGF2BP1结合的RBRP G19A突变体并未增加内源性IGF2BP1与m6A-甲基化的c-Myc CRD RNA寡核苷酸的结合(图5d)。 RIP-qPCR分析还表明,RBRP G19A突变体并未增强细胞中内源性IGF2BP1与c-Myc CRD RNA的结合(图5e)。此外,重组G19A突变的RBRP多肽未增加重组IGF2BP1蛋白与m6A甲基化的c-Myc mRNA CDR寡核苷酸的结合(图5f)。在野生型(WT)RBRP表达的细胞中,与IGF2BP1结合的RNA比在RBRP G19A突变体表达的细胞中具有更多的RNA m6A修饰丰度(图5g)。这些结果表明,RBRP通过其G19残基增加了IGF2BP1与m6A修饰的c-​​Myc CRD mRNA的结合。


图5 RBRP肽而不是lncRNA LINC00266-1本身增强了m6A阅读器IGF2BP1与m6A修饰的c-​​Myc CRD mRNA的识别和结合。a在稳定表达LINC00266-1 ORF或5'UTR-ORFmut(MT)的HCT-116细胞中,通过RNA下拉测定法研究了IGF2BP1与m6A-未甲基化或甲基化的c-Myc CRD mRNA寡核苷酸的体外结合。b通过RIP-qPCR分析(n = 3个独立实验)确定了细胞中IGF2BP1在c-Myc CRD mRNA上的体内结合。c如使用抗m6A抗体通过斑点印迹检测的那样,在细胞中检测到IGF2BP1结合的RNA中m6A的水平。d。将WT或G19A突变的RBRP-Flag载体转染到具有稳定的LINC00266-1表达的shRNA(sh266)的HCT-116细胞中;通过RNA下拉测定法分析了IGF2BP1与m6A-未甲基化或-甲基化的c-Myc CRD mRNA寡核苷酸的体外结合。e通过RIP-qPCR分析(n = 3个独立实验)确定了按d处理的细胞中IGF2BP1在c-Myc CRD mRNA上的体内结合。f 孵育重组IGF2BP1蛋白,WT或G19A突变的RBRP肽和m6A甲基化的c-Myc CRD mRNA寡核苷酸,并通过RNA EMSA分析法分析IGF2BP1对m6A甲基化的c-Myc CRD mRNA的结合能力。g通过斑点印迹在按d处理的细胞中检测到IGF2BP1结合的RNA中的m6A水平。h在稳定表达LINC00266-1 ORF或5 UTR-ORFmut(MT)的HCT-116细胞中,m6A书写者METTL14表达被沉默。 IGF2BP1在c-Myc CRD mRNA上的体内结合通过RIP-qPCR分析(n = 3个独立实验)确定。

WT或CRD突变的c-Myc质粒(sc-Myc)也被同义突变并具有抗c-Myc siRNA的同义含义,与抗c-Myc siRNA一起共转染到HCT-116细胞中,稳定表达LINC00266-1 ORF; IGF2BP1与c-Myc CRD mRNA的体内结合通过RIP-qPCR分析确定(n = 3个独立实验)。两尾未配对的学生t检验。数据表示为均值SD。 * p <0.05,** p <0.01或*** p <0.001,ns表示无意义。源数据作为源数据文件提供。

如上所示,RBRP不会增加IGF2BP1与m6A-非甲基化RNA寡核苷酸的体外结合。 RIP-qPCR分析进一步证明,当通过沉默m6A书写者METTL14的表达降低细胞RNA m6A含量时,RBRP过表达诱导的内源性IGF2BP1与c-Myc CRD RNA的结合增强显着受损。 5h和补充图9c)。此外,我们生成了一个c-Myc CRD突变体(CRDmut),其中A在c-Myc CRD中的六个m6A共有序列内被突变为U。 RIP-qPCR和m6A-PCR分析表明,当A在细胞中c-Myc CRD的六个m6A共有序列中被突变为U时,RBRP不会增加对m6A修饰的c-​​Myc CRD mRNA的IGF2BP1的识别(图5i和补充图9d),表明RBRP以m6A依赖性方式增加了IGF2BP1对c-Myc CRD mRNA的识别和结合。总而言之,RBRP而非lncRNA LINC00266-1本身增强了m6A阅读器IGF2BP1对RNA(例如c-Myc mRNA)的m6A识别和结合。

RBRP通过增强IGF2BP1对c-Myc mRNA的m6A识别来增强c-Myc mRNA的稳定性。先前的研究表明,IGF2BP蛋白以m6A依赖性方式增强靶mRNA的稳定性[6]。因此,我们进一步研究了RBRP对c-Myc mRNA稳定性的影响。 RBRP,而不是lncRNA LINC00266-1本身,增加了c-Myc mRNA的稳定性以及c-Myc mRNA和蛋白质水平(图6a-c)。 IGF2BP1的沉默完全阻止了RBRP过表达诱导的c-Myc mRNA稳定性的增强(图6d),表明RBRP主要通过m6A阅读器IGF2BP1增强了c-Myc mRNA的稳定性。

此外,当敲低m6A编写者METTL14时,由RBRP过表达诱导的c-Myc mRNA稳定性增强被取消(图6e),这表明RBRP介导的c-Myc mRNA稳定性取决于mRNA m6A修饰。 c-Myc CRD mRNA的六个m6A共有位点内的A到U突变显着消除了RBRP过表达诱导的c-Myc mRNA稳定性的增强以及c-Myc mRNA和蛋白水平的提高(图6f-h)。这些结果表明,RBRP以c-Myc CRD mRNA m6A依赖性方式增加c-Myc mRNA的稳定性。接下来,我们试图确定临床样品中RBRP肽水平和c-Myc水平是否相关。 CRC组织中的c-Myc mRNA和蛋白质水平高于相应的非肿瘤大肠组织(图6i,j)。 c-Myc水平与临床样品组织中RBRP肽水平呈正相关(R2 = 0.5921,p = 0.0093)(图6k)。

图6  RBRP通过调节IGF2BP1对c-Myc CRD mRNA的m6A识别来提高c-Myc mRNA的稳定性和表达。a-c RBRP过表达,但lncRNA LINC00266-1本身未增加,增加了c- Myc mRNA和c- Myc的半衰期(a)(n =实验)和水平(b)(n = 3独立实验)。图5a中所示细胞中的Myc蛋白水平(c)。 d,e通过沉默图5a(n)所示细胞中的m6A读取器IGF2BP1(d)或m6A写入器METTL14(e)来阻止RBRP(ORF)诱导的c-Myc mRNA半衰期的延长。 =实验)。 f h细胞按图5h处理。 RBRP过表达并没有增加c-Myc mRNA的半衰期(f)(n =一个实验)或水平(h)(n = 3个独立实验),也没有增加A突变为c-Myc蛋白的水平(g)。 c-Myc mRNA CRD中六个m6A共有位点内的U。i,j在图2c所示的CRC组织样本中确定c-Myc蛋白(i)和mRNA(j)(n = 3个独立实验)的水平。与相应的NT相比,CRC组织(T)中的c-Myc蛋白和mRNA水平升高。k使用线性回归分析,临床组织样品(n = 10个样品)中c-Myc蛋白水平与RBRP肽水平呈正相关。除非特别说明,否则两尾不配对的学生t检验。数据表示为均值SD。 * p <0.05,** p <0.01或*** p <0.001,ns表示无意义。源数据作为源数据文件提供。

已经确定了RNA稳定剂HuR,MATR3和PABPC1可调节靶mRNA的稳定性[22-24]。我们证明了RBRP以独立于RNA的方式增加了IGF2BP1与RNA稳定剂HuR,MATR3和PABPC1的相互作用,而RBRP中的G19A突变(不与IGF2BP1结合)并没有增加IGF2BP1与这些RNA稳定剂的结合(补充图10a,b)。此外,RBRP增强了这些RNA稳定剂与m6A-RNA探针和m6A-甲基化c-Myc CRD RNA的结合,但没有促进这些RNA稳定剂与m6Aunmethylated RNA探针和m6A-非甲基化c-Myc CRD RNA的结合(补充图10c,d)。但是,不与IGF2BP1结合的RBRP G19A突变体并没有增加这些RNA稳定剂与m6A-甲基化c-Myc CRD RNA的结合(补充图10e)。因此,RBRP加强了RNA稳定剂HuR,MATR3和PABPC1向m6A-c-Myc CRD RNA的募集,以促进c-Myc mRNA的稳定性并上调c-Myc水平。总体而言,我们的结果表明,RBRP通过增强c-Myc CRD mRNA上的IGF2BP1对m6A的识别以及将RNA稳定剂募集到m6Amethylated-c-Myc CRD mRNA来提高c-Myc mRNA的稳定性。

RBRP通过c-Myc促进肿瘤发生。 C-Myc是关键的,著名的癌基因。接下来,我们研究了RBRP是否通过c-Myc促进了肿瘤发生,因为RBRP驱动了m6A识别依赖性c-Myc mRNA的稳定性。将ORF(编码RBRP肽)或MT(MUT)(LNC00266-1 lncRNA)构建体与抗c-Myc siRNA一起共转染到细胞中(补充图11a)。 RBRP过表达诱导的细胞增殖,集落形成以及迁移和侵袭的增加被c-Myc敲低完全阻止了(补充图11b-d)。因此,RBRP主要通过c-Myc促进肿瘤发生。

RBRP通过结合IGF2BP1发挥其致癌作用。如上所示,RBRP增加了IGF2BP1对RNA的m6A识别,并通过IGF2BP1促进c-Myc mRNA稳定性和肿瘤发生。因此,我们进一步检查了RBRP是否以IGF2BP1结合依赖性方式促进肿瘤发生和c-Myc mRNA稳定性。在靶向RBRP ORF 3'-UTR的LINC00266-1 shRNA耐药的WT RBRP或IGF2BP1结合缺陷型突变RBRP G19A的表达在具有稳定敲低LINC00266-1的CRC细胞中得以恢复。敲低LINC00266-1可显着降低c-Myc mRNA的稳定性和水平,细胞生长,集落形成,迁移和侵袭,而在与WT RBRP共转染但未与IGF2BP1结合缺陷型突变体共转染的细胞中,这些改变被恢复至对照水平。 RBRP G19A(图7),表明RBRP通过结合IGF2BP1促进肿瘤发生和c-Myc mRNA稳定性。

已经确定了RNA稳定剂HuR,MATR3和PABPC1可调节靶mRNA的稳定性[22-24]。我们证明了RBRP以独立于RNA的方式增加了IGF2BP1与RNA稳定剂HuR,MATR3和PABPC1的相互作用,而RBRP中的G19A突变(不与IGF2BP1结合)并没有增加IGF2BP1与这些RNA稳定剂的结合(补充图10a,b)。此外,RBRP增强了这些RNA稳定剂与m6A-RNA探针和m6A-甲基化c-Myc CRD RNA的结合,但没有促进这些RNA稳定剂与m6Aunmethylated RNA探针和m6A-非甲基化c-Myc CRD RNA的结合(补充图10c,d)。但是,不与IGF2BP1结合的RBRP G19A突变体并没有增加这些RNA稳定剂与m6A-甲基化c-Myc CRD RNA的结合(补充图10e)。因此,RBRP加强了RNA稳定剂HuR,MATR3和PABPC1向m6A-c-Myc CRD RNA的募集,以促进c-Myc mRNA的稳定性并上调c-Myc水平。总体而言,我们的结果表明,RBRP通过增强c-Myc CRD mRNA上的IGF2BP1对m6A的识别以及将RNA稳定剂募集到m6Amethylated-c-Myc CRD mRNA来提高c-Myc mRNA的稳定性。

RBRP通过c-Myc促进肿瘤发生。 C-Myc是关键的,著名的癌基因。接下来,我们研究了RBRP是否通过c-Myc促进了肿瘤发生,因为RBRP驱动了m6A识别依赖性c-Myc mRNA的稳定性。将ORF(编码RBRP肽)或MT(MUT)(LNC00266-1 lncRNA)构建体与抗c-Myc siRNA一起共转染到细胞中(补充图11a)。 RBRP过表达诱导的细胞增殖,集落形成以及迁移和侵袭的增加被c-Myc敲低完全阻止了(补充图11b-d)。因此,RBRP主要通过c-Myc促进肿瘤发生。

RBRP通过结合IGF2BP1发挥其致癌作用。如上所示,RBRP增加了IGF2BP1对RNA的m6A识别,并通过IGF2BP1促进c-Myc mRNA稳定性和肿瘤发生。因此,我们进一步检查了RBRP是否以IGF2BP1结合依赖性方式促进肿瘤发生和c-Myc mRNA稳定性。在靶向RBRP ORF 3'-UTR的LINC00266-1 shRNA耐药的WT RBRP或IGF2BP1结合缺陷型突变RBRP G19A的表达在具有稳定敲低LINC00266-1的CRC细胞中得以恢复。敲低LINC00266-1可显着降低c-Myc mRNA的稳定性和水平,细胞生长,集落形成,迁移和侵袭,而在与WT RBRP共转染但未与IGF2BP1结合缺陷型突变体共转染的细胞中,这些改变被恢复至对照水平。 RBRP G19A(图7),表明RBRP通过结合IGF2BP1促进肿瘤发生和c-Myc mRNA稳定性。

图7     RBRP通过与IGF2BP1结合来调节c-Myc mRNA的稳定性和肿瘤发生。a-e将抗LINC00266-1 shRNA的WT或G19A突变的RBRP构建体通过靶向3-U​​TR的抗LINC00266-1 shRNA慢病毒转染入HCT-116细胞,并稳定敲低LINC00266-1表达LINC00266-1 ORF(sh266);检测到c-Myc mRNA的半衰期(a)(n =一个实验)和水平(b)(n = 3个独立实验),以及细胞增殖(c)(n = 3个独立实验),集落形成(d)(n = 3个独立实验),以及迁移和入侵(e)(n = 5个独立实验)。比例尺:50μm。 RBRP的G19A突变不与m6A阅读器IGF2BP1结合,废除了RBRP对c-Myc稳定性和表达以及癌细胞增殖,集落形成,迁移和侵袭的刺激作用。除非另有说明,否则两尾不配对的学生t检验是c中的双向ANOVA。数据表示为均值SD。 * p <0.05,** p <0.01或*** p <0.001,ns表示无意义。源数据作为源数据文件提供。

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2020-06-03 23:39 浏览 : 3599 回复 : 1
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longlong55 编辑于 2020-06-04 07:19
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m6A RNA修饰在转录后基因的调控,发育和疾病(例如癌症)中起着重要作用[1,2]。 m6A RNA修饰通过m6A阅读器发挥其生物学重要性。但是,这些m6A读者如何识别其目标成绩单仍然未知。在这项研究中,我们发现由先前注释的,未表征的lncRNA LINC00266-1编码的未表征的肽肽RBRP在癌症中显着上调,并增强了m6A阅读器IGF2BP1对靶标mRNA(例如c-Myc mRNA)的识别和结合增加c-Myc mRNA的稳定性和水平,从而促进肿瘤发生。

m6A RNA途径的效应子包括作者METTL3和METTL14。橡皮擦FTO和ALKBH5;读者YTHDF1-3,YTHDC1-2,IGF2BPs和hnRNPs [1,2,4 8]。 m6A RNA修饰主要通过METTL3和METTL14进行安装,它们分别是催化亚基和促进RNA结合的重要组成部分[3]。除METTL3和METTL14外,最近的研究进一步表明,包括WTAP,VIRMA,ZC3H13,HAKAI和RBM15 / 15B在内的少数其他调控亚基,在RNA上m6A的安装中也起着重要作用[9-12 ]。但是,没有报道RNA m6A阅读器和m6A去甲基化酶的其他调控亚基。在这项研究中,我们的发现表明m6A读者还包含其他调节亚基。在这里,我们发现lncRNA LINC00266-1编码的肽肽RBRP是RNA m6A阅读器IGF2BP1的调节亚基,并调节IGF2BP1对靶RNA的m6A识别。我们的发现揭示了m6A途径和m6A识别的额外调控层。

m6A RNA甲基化正在成为影响多种癌症标志的途径[2]。已确定m6A RNA的书写,擦除和读取器在几种癌症中表达异常,并以m6A依赖性的方式调节癌症的发生,增殖,干性,转移,对化学/放射疗法的抗性和肿瘤发生[25-30] 。尽管据报道m6A编写者WTAP,VIRMA,ZC3H13和HAKAI的调节亚基与癌症有关[31-33],但尚未报道它们在癌症中的功能作用是否依赖于m6A修饰。在这项研究中,我们发现m6A阅读器的调节亚基RBRP以m6A和m6A阅读器依赖的方式促进癌细胞增殖,集落形成,肿瘤发生和转移。 RBRP通过IGF2BP1增强了对目标mRNA(例如癌基因c-Myc mRNA)的m6A识别,从而提高了c-Myc mRNA的稳定性和水平,从而促进了肿瘤的发生。当细胞c-Myc CRD mRNA中不存在m6A修饰时,RBRP对m6A识别,mRNA稳定性和肿瘤发生的增强作用就会减弱。我们的结果表明,除了异常的m6A修饰与癌症密切相关外,由m6A阅读器的调节亚基介导的异常m6A识别也与癌症密切相关。

RBRP肽是未经鉴定的肽,由先前注释的具有功能未知的lncRNA LINC00266-1编码。相互作用组学和质谱分析确定总共有107种蛋白质与LINC00266-1-编码的肽相互作用。基因注释分析表明,这107种蛋白中有76种属于RNA结合蛋白。因此,我们将其称为LINC00266-1-编码肽RBRP。 RBRP肽而非lncRNA LINC00266-1本身,发挥其致癌作用,可在体外促进癌细胞增殖,集落形成,迁移和侵袭,并在体内促进肿瘤发生和转移。因此,RBRP被进一步称为肽。抑制RBRP可以显着抑制癌细胞的增殖,集落形成,迁移和侵袭。 m6A RNA的书写者,擦除者和阅读者被认为是抗癌的治疗靶标[1,34]。我们的结果表明,m6A阅读器的调节性亚基RBRP肽可能是潜在的癌症预后生物标志物和治疗靶标。

除了通过与IGF2BP1相互作用使RBRP在m6A识别中的作用外,基因注释分析还表明RBRP相互作用子主要参与RNA剪接的调控,许多剪接调节子与RBPR相互作用,包括10个hnRNP家族蛋白,7个剪接因子和两种核小核糖核蛋白,据报道其中大多数都参与了癌症标志的调控[17,35,36],这表明RBRP可能还调节了mRNA的前剪接,从而调节了肿瘤的发生和癌症的发展。因此,RBRP与其他相互作用者的相互作用将对下一步的研究很有价值。

迄今为止,在人类基因组中已经鉴定出超过28,000个lncRNA转录本。 LncRNA逐渐成为基因表达的重要调控分子,并且在功能上与RNA分子密切相关。 lncRNA的失调促成各种癌症标志[16-18]。但是,到目前为止,尚无lncRNA参与参与RNA上m6A的安装,去除或识别的报道。在我们目前的研究中,我们的发现揭示了lncRNA LINC00266-1参与了m6A读者的m6A识别,而lncRNA LINC00266-1通过编码一种多肽来代替RNA分子来发挥其m6A识别调节作用。我们和以前的研究表明,有限数量的lncRNA和circRNA可以编码蛋白质/肽来调节肿瘤发生[37-40]。我们的发现进一步证实了某些肽隐藏在某些先前注释的lncRNA中。我们的报告丰富和扩大了非编码RNA功能和机制在m6A RNA途径和肿瘤发生中的广度和多样性。

总之,先前注释的lncRNA LINC00266-1实际上编码了未表征的肽RBRP,该肽在肿瘤发生中具有致癌作用。这一发现突出了靶向RBRP在癌症中的治疗潜力。 RBRP肽作为m6A阅读器的另一个调控亚基,可通过m6A阅读器IGF2BP1增强对RNA(例如c-Myc mRNA)的m6A识别,从而增加c-Myc mRNA的稳定性和表达。我们的研究发现了lncRNA及其编码的肽与m6A RNA途径之间的联系。

方法

细胞培养和组织样本。 SW480,SW620,HCT-116,MBA-MD-231,SKOV-3,OVAR-3,HeLa和HEK293T细胞系购自美国典型培养物保藏中心,并在标准条件下培养。我们的研究小组先前建立了具有增强转移能力的HCT-116high,MDA-MB-231high,OVCAR-3high和SK-OV-3high细胞亚系[17,41]。 S18和S26细胞系的提供如我们先前的研究所述[17]。定期监测细胞的支原体污染。

在中山大学癌症中心从患有CRC的患者中收集匹配的新鲜冷冻的原始CRC组织及其相应的结直肠组织的非肿瘤样品。这些病例是根据明确的病理学诊断选择的,术前未接受抗癌药治疗。这些组织样本的收集得到广州医科大学附属第三医院内部审查和伦理委员会的批准。从每个患者获得知情同意。组织微阵列芯片包含90对匹配的CRC组织样品,其对应的相邻非肿瘤大肠组织样品以及相关的临床病理数据,均购自上海OUTDO Biotech Co.,Ltd(上海)。

抗RBRP抗体的产生。合成了表位肽,由GL Biochem(Shanghai),Ltd.生产了抗RBRP抗体。简要地,合成了KLH偶联肽Cys-TDTKKDKHPHPDPY(CY-13),并从接种的兔中获得了针对RBRP的多克隆抗体。使用亲和色谱法在含有相应表位肽的柱子上进一步纯化抗体。

质粒构建体。如先前所述[17],产生了LINC00266-1和其他lncRNA ORF-GFPmut,ORF,5U和MT,IGF2BP1-HA,IGF2BP1-Flag,c-Myc-Flag质粒。 IGF2BP1-HA MUT1,MUT2,MUT3,MUT4,GxxGΔ(GxxG突变为GEEG)突变体,RBRP-Flag G19A,G63A和G19A / G63A突变体,c-Myc CRDmut突变体以及同义突变的IGF2BP1和c-Myc突变体是。使用Mut Express II快速诱变试剂盒V2(Vazyme,中国)生成。补充表3提供了ORF,5'U和MT序列。

RNA干扰。将针对LINC00266-1,IGF2BP1或c-Myc基因或NC siRNA(GenePharma)的siRNA(60 nM)用RNAiMAX(Invitrogen)转染细胞48小时(除非另有说明)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)共转染质粒和50 nM siRNA 48小时(除非另有说明)。

siRNA序列在补充表3中提供。

免疫荧光染色。用LINC00266-1和其他lncRNA ORF-GFPmut载体转染HeLa细胞,并直接观察和记录GFP荧光。用指定的质粒或指定的siRNA转染HeLa细胞24小时,然后将这些细胞铺板并在玻璃盖玻片上培养24小时。这些细胞用4%多聚甲醛固定,用0.1%Triton X-100透化,并与抗RBRP或抗Flag抗体在4 C下孵育过夜。随后,这些细胞用相应的Alexa Fluor 488或Cy3偶联的IgG二级抗体(1:1000)处理,细胞核用DAPI染色。通过激光扫描共聚焦显微镜获得图像。

蛋白质印迹。制备全细胞裂解物和组织裂解物,并按照先前的描述确定蛋白质浓度[42]。使用10个12.5%Tris-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离全细胞裂解物和组织裂解物,然后电印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用抗RBRP(我们开发的1:500),Flag(M185-3L,MBL,RRID:AB_11123930、1:2000),HA(561,MBL,RRID:AB_591839、1:2000)检测指定的蛋白GFP(50430-2-AP,Proteintech,RRID:AB_11042881,1:1000),IGF2BP1(8482,CST,1:1500),c-Myc(13987,CST,RRID:AB_11179079,1:1000),m6A(ABE572 ,Merck Millipore,1:2000),HuR(11910-1- AP,Proteintech,RRID:AB_11182183,1:2000),PABPC1(10970-1-AP,Proteintech,RRID:AB_10596918,1:2000),MATR3(12202) -2-AP,Proteintech,RRID:AB_2281752,1:2000)和β-肌动蛋白(60008-1-Ig,Proteintech,RRID:AB_2289225,1:4000)抗体。

Tricine-SDS-PAGE和低分子量肽检测。制备全细胞裂解物和组织裂解物,并如先前所述确定蛋白质浓度[42]。如先前所述[17,43],将全细胞裂解物和组织裂解物在16%Tricine-SDS-PAGE凝胶上分离,然后电印迹到PVDF膜上。使用抗Flag(M185-3L,MBL,RRID:AB_11123930)或抗RBRP(1:500)抗体进行Western印迹法以检测RBRP肽段。

RT-PCR和qRT-PCR。

使用TRIzol总RNA分离试剂(Invitrogen)提取总RNA或RIP RNA。使用逆转录PCR(RT-PCR)或定量RT-PCR(qRT-PCR)测定LINC00266-1 lncRNA,IGF2BP1,METLL14,c-Myc,c-Myc CRD和GAPDH mRNA水平。补充表3提供了RT-PCR和qRT-PCR引物的序列。

IHC分析。如先前所述,使用抗RBRP抗体进行IHC检测44。使用抗RBRP抗体(1:600)在结肠癌组织微阵列芯片上进行IHC分析。所有IHC结果均由两名不了解样品来源和受试者结果的独立病理学家进行评估。使用先前描述的半定量德国评分系统,用阳性细胞百分比和染色强度评估RBRP肽水平评分。 0-3的分数表示癌组织中的RBRP微量肽水平低(低),而4-7的分数表示癌组织中的RBRP微量肽水平高(高)。

细胞增殖测定。如前所述进行细胞增殖测定[17,41]。简而言之,将细胞用指定的siRNA和/或质粒转染12小时。将这些细胞悬浮,然后将1 104个细胞铺在96孔培养板上,并在补充有10%胎牛血清(FBS)的培养基中培养。细胞数在24、48、72、96和120小时计数。

菌落形成测定。如前所述进行细胞增殖测定[17,41]。简而言之,将细胞用指定的siRNA和/或质粒转染12小时。然后,将250个细胞铺在六孔培养板上,并在补充有10%FBS的培养基中培养。然后将这些细胞用甲醇固定,并用结晶紫溶液染色。在显微镜下计数菌落数(n = 3)。

迁移和入侵检测。如前所述使用Transwell腔室进行体外迁移和侵袭试验45。用指定的siRNA或/和质粒转染细胞。将100μL具有0.05%FBS的细胞悬液中的总共100000个细胞添加到上迁移孔室中进行迁移测定(8.0μM孔径,BD),或将涂有Matrigel的上迁移孔室中进行侵袭测定,并添加10将%FBS添加至底部室。迁移的和浸润的细胞用5%的结晶紫染色。从每个膜获得图像,并在显微镜下计数迁移的细胞和侵袭细胞。

具有稳定表达的细胞系的构建。稳定表达Luc的HCT-116-Luc细胞系是我们小组先前建立的[17]。用表达指定的LINC00266-1构建体的慢病毒进一步感染HCT-116-Luc细胞,并使用嘌呤霉素进行选择。通过蛋白质印迹验证了RBRP-Flag融合蛋白的异位表达。稳定表达LINC00266-1-ORF-Flag(HCT-116-Luc-LINC00266-1-ORF-Flag),LINC00266-1-5'U(HCT-116-Luc- LINC00266-1-5')的HCT-116细胞系建立了UTR-ORF-Flag)或LINC00266-1-MT(HCT-116-Luc-LINC00266-1-MT)。用表达靶向LINC00266-1 ORF 3'-UTR区的LINC00266-1 shRNA的慢病毒感染HCT-116细胞,并用嘌呤霉素进行选择。建立稳定表达LINC00266-1 shRNA的HCT-116细胞系。

动物研究。雄性BALB / c裸鼠(3-4周大)购自中国(北京)的查尔斯河实验室。如先前所述进行体内肿瘤发生测定[17,41]。简要地说,将1106 HCT-116-Luc-LINC00266-1-ORF-标记,HCT-116-Luc-LINC00266-1-5 U或HCT-116-Luc-LINC00266-1-MT细胞皮下注射到背侧每个BALB / c裸鼠的侧面(n = 6)。 3周后,处死小鼠,解剖肿瘤并称重。

从中国查尔斯河实验室获得雄性NOD-SCID小鼠(3-4周龄)。使用先前描述的方法进行体内转移测定[17,41]。简而言之,在每个实验组的NOD-SCID小鼠中注射2 106 HCT-116-Luc-LINC00266-1-ORF-Flag,HCT-116-Luc-LINC00266-1-5'U或HCT-116-Luc- LINC00266-1-MT细胞通过尾静脉(n = 5)。植入后9周,使用IVIS 200成像系统(Xenogen)观察转移灶。

这些实验中使用的小鼠在暨南大学医学院动物实验中心(SPF级设施)的规定条件下饲养和饲养,环境温度和湿度分别为22℃和40-70%。动物实验得到广州医科大学第三附属医院和暨南大学实验动物伦理委员会的批准,符合有关实验动物护理和维护的法律规定和国家指导原则。

免疫共沉淀测定。用指定的质粒转染细胞。如先前报道[42],从细胞中制备全细胞裂解物。使用抗Flag或抗HA抗体进行免疫共沉淀测定(Co-IP),并将免疫复合物捕获在Protein A / G琼脂糖珠(Santa Cruz)上。共IP复合物被分离。凝胶用银染色用于MS分析,或用于带有指定抗体的Western印迹分析。对于MS分析,进行了三个独立的实验;切下不同的凝胶带及其相应的阴性凝胶带,并用胰蛋白酶进行凝胶消化。

MS测定。为了鉴定外源性RBRP肽,将LINC00266-1 ORFGFPmut质粒转染到HeLa细胞中,使用抗GFP抗体免疫沉淀RBRP-GFP融合肽,通过SDS-PAGE分离免疫沉淀的RBRPGFP并用银染色,然后将RBRP切下-GFP凝胶带,并用胰蛋白酶在凝胶中消化。为了鉴定内源性RBRP肽,通过tricine-SDSPAGE分离来自肿瘤组织的总蛋白并用银染色。切下约8 kDa的凝胶带,并用胰蛋白酶进行凝胶消化。

如前所述[17]通过MS进行蛋白质鉴定。 MS分析由深圳Wininnovate Bio。进行。简而言之,将提取的肽混合物溶解在含有0.1%甲酸和2%乙腈(AcN)的缓冲液中,以5-40%的梯度(0.1%甲酸和95%AcN)洗脱,并使用纳米级液相色谱MS / MS AB SCIEX TripleTOF 5600,美国)。使用依赖于信息的采集质谱技术,以2.4 kV的离子喷雾电压,35 PSI的气幕压力,12 PSI的雾化压力以及150 C的界面加热温度来采集串联MS数据。根据相关采集,在250毫秒内采集了调查扫描,最多收集了40次产物离子扫描(60毫秒)。仅选择电荷状态为2到4的光谱以通过碰撞诱导的离解诱导碎片化。循环时间设置为2.5 s。动态排除设置为16 s。

使用Protein Pilot Software v4.5(AB SCIEX)将WIFF RAW文件转换为峰列表文件。为了鉴定RBRP相互作用子,使用Mascot(v2.3.02)程序对带有默认参数的Uniprot人蛋白质数据库(2014年12月发布)进行了蛋白质鉴定。错误发现率为1%,蛋白质得分为40,独特的肽≥2。为了鉴定外源性和内源性RBRP肽,使用Mascot(2.6.2版)程序对我们使用默认参数生成的RBRP蛋白质数据库进行蛋白质鉴定。简而言之,采用以下参数:酶是胰蛋白酶;允许两个错过的卵裂;将氨基脲甲基(C)设置为固定修饰,而将乙酰基(Protein N-term),脱酰胺基(NQ)和氧化(M)视为可变修饰。前体离子质量公差和碎片离子质量公差为20 p.p.m. 和0.1 Da,分别。

RNA亲和纯化。 GeneScript(China)合成了含有A或m6A的生物素标记的RNA寡核苷酸。如前所述[17]进行RNA亲和纯化。简而言之,使用核和细胞质蛋白提取试剂盒(Beyotime)从细胞中制备核提取物。将每1 nmol的带有A或m6A的生物素标记的RNA与100μL的链霉亲和素琼脂糖珠(Sigma)在4℃旋转过夜结合。将固定有RNA的珠子与核混合物混合,并在30℃下孵育30分钟。通过添加30μL蛋白质上样缓冲液洗脱这些珠,并煮沸5分钟。然后使用蛋白质印迹分析洗脱的混合物。这些A-或m6A-寡核苷酸序列在补充表3中提供。

RNA电泳迁移率变动分析。按照制造商的说明和以前的报道,通过LightShift RNA EMSA优化和对照试剂盒(Thermo Fisher)进行RNA电泳迁移率迁移测定(EMSA)[46]。简而言之,如前所述,根据试剂盒说明书(FLAGIPT1,Sigma)从HEK293T细胞中过表达并纯化IGF2BP1-Flag蛋白,​​WT和G19A突变的RBRP多肽[41]。将生物素标记的m6ARNA寡核苷酸(20 pmol),6μg重组IGF2BP-Flag蛋白与2μg重组RBRP-Flag多肽或RBRP-Flag G19A突变体多肽混合,并在室温下孵育30分钟。然后,将1μl的0.2%戊二醛添加到混合物中,并在冰上孵育15分钟。然后,在6%TBE(450mM Tris,450mM硼酸,10mM EDTA pH 8.3)凝胶上分离RNA-蛋白质/肽类混合物。将凝胶转移到带正电的尼龙转移膜(GE Healthcare)上,并通过紫外线使RNA膜交联。按照制造商的说明,通过化学发光核酸检测模块(Thermo Fisher)检测生物素标记的m6A-RNA寡核苷酸。这些A-或m6A-寡核苷酸序列在补充表3中提供。

RIP分析。如先前所述进行RIP,但进行了较小的修改6。简而言之,细胞通过紫外线交联并通过胰蛋白酶消化收集。使用核和细胞质蛋白提取试剂盒(Beyotime)从细胞中制备核提取物。将抗IGF2BP1或抗HA抗体,或相应的对照IgG抗体与蛋白A / G琼脂糖珠(Santa Cruz)在4℃孵育4 h,然后在RIP缓冲液(150mM KCl,25mM)中与预先清除的核提取物一起孵育Tris(pH 7.4),5mM EDTA,0.5mM二硫苏糖醇,0.5%NP40、1种蛋白酶抑制剂)在4℃过夜添加RNase抑制剂。将共IP复合物在37℃下用DNase消化15分钟,在37℃下用蛋白酶K消化15分钟。通过TRIzol(Invitrogen)提取输入和共IP RNA,并通过qPCR确定。如前所述,通过归一化输入来计算每个样品中相关的RNA富集6。基因特异性m6A qPCR。 C-Myc mRNA m6A水平的测定如先前所述[6]。简而言之,用超声仪(Covaris M220)剪切总RNA。将抗m6A抗体或相应的对照IgG抗体与蛋白A / G琼脂糖珠(Santa Cruz)在4℃孵育4 h,然后在带有RNase抑制剂的RIP缓冲液中将剪切的RNA在4孵育6 h ℃。免疫沉淀的m6A-甲基化的RNA在37℃的DNA酶中消化15分钟,在37℃的K蛋白酶中消化15分钟,然后用TRIzol(Invitrogen)提取并通过qPCR测定。通过归一化输入来计算每个样品中m6A的相关富集。

RNA m6A点印迹。 RNA点印迹按先前所述进行了少量修改[41]。简要地,将总RNA或RIP免疫沉淀的RNA在55℃下放置15分钟以在变性缓冲液(2.2M甲醛,50%去离子甲酰胺,0.5MOPS缓冲液)中变性。将RNA在95℃加热10分钟,并在冰上冷却5分钟。然后将RNA点到Amersham Hybond-N +膜(GE Healthcare,目录号RPN303B)上,并通过紫外线交联。用抗m6A抗体检测到RNA上的m6A修饰。

mRNA的半衰期和mRNA稳定性测定。用5μg/ ml放线菌素D处理70-80%汇合的细胞,并在指定的时间点收集细胞。通过TRIzol(Invitrogen)提取总RNA,并通过RT-PCR测定c-Myc mRNA水平。凝胶带的强度通过ImageJ(v1.8.0)程序测量。根据先前报道的方法计算mRNA的周转率和半衰期[6]。

同义突变体的构建。构建了分别抗IGF2BP1和c-Myc siRNA的IGF2BP1-HA和c-Myc-HA的同义突变体。将WT和GxxGΔ突变的IGF2BP1-HA质粒中的抗IGF2BP1 siRNA靶向序列5'-CTCCGGGAAAGTAGAATT-3'同义突变为5'-CTCAGGAAAGGTGGAGTT-3'。产生了同义突变体sIGF2BP1-HA和sIGF2BP1-HAGxxGΔ。 WT和CRDmut突变的c-Myc-HA质粒中的抗c-Myc siRNA靶向序列5'-GTGCAGCCGTATTTCTACT-3'同义突变为5'- GTACAACCATACTTTTTATT-3'。产生了同义突变体sc-Myc-HA和sc-Myc-HA CRDmut。

统计分析和可重复性。除非明确说明,否则使用不调整的两尾不配对Student t检验来比较两组之间的数据。 Mann Whitney U检验用于比较两组之间的临床数据,并在图例中进行了说明。使用双向方差分析来分析生长曲线的显着性。除非另有说明,将治疗组与对照进行比较。使用Kaplan Meier方法分析生存曲线,并使用对数秩检验进行比较。使用Prism 5或Prism 8软件和SPSS程序进行统计分析。除非另有说明,否则n = 3个独立实验。进行了两个独立的实验,用于免疫荧光染色测定。其余结果进行了一次独立实验。除非另有说明,否则数据均以均值SD表示; * p <0.05,** p <0.01,*** p <0.001和ns,无统计学意义。

报告摘要。有关研究设计的更多信息,请参见与本文链接的《自然研究报告摘要》。

资料可用性。用于鉴定外源性和内源性RBRP肽的质谱蛋白质组学数据已通过iProX47合作伙伴存储库(数据集标识符PXD016267和PXD016268)存放到ProteomeXchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)。包括免疫荧光图像在内的所有细胞学图像的大图(图1a,b,2a,3c,d,7d,e和补​​充图2a,b,e,5b,c,e,f,6c, d,7c,d,11c,d)和未裁剪的凝胶和印迹(图1c,2b,c,3a,4a,5a,c,d,f,g,6c,g,i和补充图2c ,d,4a,c,6a,7a,8a d,9b,c,10a e,11a)被提供为源数据文件。我们所有直方图和折线图的原始数据(图2e g,3b e,g,5b,e,h,i,6a,b,df,h,j,k,7a e和补充图2c,提供4b,d,5af,6bd,7bd,9a,d,11bd)作为源数据文件。所有其他相关数据均应合理要求从相应的作者处获得。

参考文献:详见原文。

2020-06-04 07:19
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