Epac1在转基因小鼠heart过表达挽救脂多糖诱导的心功能障碍，抑制Jak-STAT通路

摘要：促炎性细胞因子通过Jak-STAT途径在败血性休克中释放并损害heart功能。众所周知，交感神经刺激导致β-肾上腺素受体/ Gs /腺苷酸环化酶的偶联，一种膜结合酶催化ATP转换为cAMP，从而刺激蛋白激酶A（PKA）并最终弥补heart功能障碍。传统上，儿茶酚胺的这种补偿机制被理解为PKA介导的心肌收缩力的增强。假设由环AMP（Epac）激活的交换蛋白是cAMP信号传导的新靶标，其独立于蛋白激酶A发挥作用，也起着关键作用。在防止急性应激或血液动力学超负荷变化中起保护作用。

脂多糖注射诱导小鼠细胞因子释放和严重的heart功能障碍。但是，在heart中过表达Epac1的小鼠中，这种功能障碍的程度明显较小。 Epac1的过表达抑制了Jak-STAT通路，如STAT3的磷酸化降低和SOCS3的表达增加所表明，随后iNOS的表达受到抑制。在用异丙肾上腺素或福司可林处理的培养的心肌细胞中，当用siRNA沉默Epac1或PKCα时，SOCS3表达的增加减弱。 cAMP / Epac /PKCα途径的激活可保护heart免受细胞因子诱导的heart功能障碍的影响，这表明儿茶酚胺信号传导在补偿心力衰竭中的heart功能障碍中具有新的作用。 Epac1及其下游途径可能是治疗内毒素血症heart功能障碍的新靶标。

Keywords:Heart failure cAMP Epac Cytokine Signal transduction

缩写：Epac，被cycloAMP激活的交换蛋白；PKC，蛋白激酶C；LVEF，左室射血分数；

TNF，肿瘤坏死因子；IL，白介素；Jak-STAT，janus激酶信号转导子和转录激活子；

SOCS3，细胞因子信号传导抑制因子3；LPS，脂多糖；AR，肾上腺素能受体；

AC，腺苷酸环化酶；cAMP，循环AMP；PKA，蛋白激酶A；8-CPT-AM，8-（4-氯苯硫基）-2-O-Me-cAMP-AM;Epac1TG，转基因小鼠，具有heart特异性Epac1过表达；

NTG，非转基因小鼠；DAB，3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐;IFN-γ，干扰素-γ；

KC，角质形成细胞衍生的趋化因子；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1；RANTES，受激活的正常T细胞表达和分泌的调节；

PBS，磷酸盐缓冲盐水；LVEDD，左心室舒张末期直径；LVESD，左室收缩末期直径；

ISO，异丙肾上腺素； LVW，LV重量；iNOS，诱导型一氧化氮合酶；PDE，磷酸二酯酶；

IBMX，3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤；PLC，磷脂酶C；NS，不重要。

1.引言

败血症与高发病率和死亡率有关。脓毒症的发病率在1979年至2000年期间从每10万人中的82.7例增加到240.4例，年增长率为8.7％[1]。败血症性心肌病是严重脓毒症的良好并发症，在败血性休克发作后的两天内，N75％的患者左室射血分数（LVEF）降低[2,3]。因此，在此期间heart功能障碍的管理对医生来说是一个关键问题。

众所周知，败血症过程中血清促炎细胞因子的水平升高，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）[4]。因为可以通过TNF-α和IL-1β的免疫吸收从化脓性血清中消除心肌抑制活性，所以这些促炎性细胞因子最有可能在化脓性心肌病的发展中发挥重要作用[5]。细胞因子受体的激活与janus激酶信号转导子和转录激活子（Jak-STAT）通路相关，这是一种主要的细胞内信号通路[6]。通过各自启动子中的STAT依赖性元件激活细胞因子受体后，诱导细胞因子信号转导3（SOCS3）蛋白的抑制剂。 SOCS3通过heart以及巨噬细胞中的Jak-STAT通路对细胞因子信号传导产生负反馈作用[7]。

随着患者败血症严重程度的增加，交感神经系统也越来越活跃[8]。输注外源性去甲肾上腺素可逆转低血压并增加平均动脉和heart功能。更重要的是，据报道，去甲肾上腺素刺激α1-肾上腺素能抑制脂多糖（LPS）诱导的心肌细胞中TNF-α的表达，并改善内毒素血症期间的heart功能障碍[9]，这表明交感神经系统的激活对病理生理学是有益的。化脓性心肌病[8,10]。由于去甲肾上腺素会激活heartβ-肾上腺素能受体（ARs）/腺苷酸环化酶（AC），从而增加循环AMP（cAMP）的产生，因此至少在最近30年中，人们认为cAMP介导的蛋白激酶A（PKA）活化是通过PKA介导的参与heart收缩和钙处理的蛋白质的直接磷酸化，是增强heart衰竭中heart收缩能力的唯一机制[11]。

然而，最近，由cAMP（Epac）激活的交换蛋白被鉴定为cAMP信号传导的新靶标，该信号独立于PKA激活[12,13]。 Epac具有两种同工型（Epac1和Epac2），两种同工型都在heart中表达[14,15]。尽管尚未确定Epac在调节heart功能中的确切作用，但该分子通过调节Rap1来调节各种细胞功能，包括迁移，增殖，胞吐作用和细胞凋亡[16]。我们假设存在一个Epac介导的cAMP信号转导通路来保存heart功能，该通路独立于PKA介导的heart收缩的机械执行。在之前的工作中，我们证明了Epac的激活减弱了对培养的心肌细胞中异丙肾上腺素的响应，对白细胞介素6（IL-6）对细胞内Ca2 +浓度和收缩力增加的抑制作用，很可能是通过抑制Jak- STAT途径通过SOCS3，随后在培养的心肌细胞中诱导型一氧化氮合酶表达发生变化[17]。

在目前的工作中，我们旨在在体内测试我们的假设。具体来说，我们使用具有heart特异性过表达Epac1的转基因小鼠在体内检查了Epac1对LPS诱导的heart功能障碍的影响，还使用了体外心肌细胞检查了Epac1对LPS诱导的与分子相关的分子信号改变的影响败血症期间的heart功能障碍。

2 材料和方法

2.1试剂

除从Biolog购买的8-（4-氯苯硫基）-2'-O-Me-cAMP-AM（8-CPT-AM）外，所有化学品均从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。生命科学研究所（德国不来梅）。

2.2心肌细胞的准备

如我们先前所述[18,19]，制备了新生大鼠心肌细胞和成年大鼠心室肌细胞的原代培养物。

2.3免疫印迹

取出heart，在液氮中速冻，并经过生理研究后储存在-80℃。制备粗制的heart膜级分或整个组织匀浆，在6-15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并印迹到硝酸纤维素膜上。使用市买抗体进行免疫印迹。 β1-AR，β2-AR，β-AR激酶（βARK），Gβ，Gγ，5/6 AC（AC5 / 6）型，蛋白激酶A（PKA）催化亚基和GAPDH抗体购自Santa Cruz Biotechnology （美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。 Gsα和Giα抗体购自PerkinElmer（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。 SOCS3抗体购自免疫生物实验室（日本群马）。 PKA调节亚基（RIIα和R1α）抗体购自BD Transduction Laboratories（美国新泽西州弗兰克林湖）。 Epac1，STAT1，STAT3，荧光蛋白STAT1（Tyr701）和荧光蛋白STAT3（Tyr705）抗体购自Cell Signaling Technology（美国丹佛市，丹佛斯）。 iNOS抗体购自Cayman Chemical（美国密歇根州安阿伯）。通过光密度测定法定量蛋白质的表达水平。在AC分析中也使用了相同的粗膜制备方法。

2.4实时定量PCR

根据制造商的协议，使用TRIzol试剂（ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）提取总RNA。通过分光光度法测定RNA浓度和质量。为了去除污染的基因组DNA，将样品用DNase I（Thermo Fisher Scientific）处理。根据制造商的说明，使用SuperScript First-Strand Synthesis System（RT-PCR试剂盒）（Thermo Fisher Scientific）对总RNA进行反转录。使用带有SYBR green系统（Thermo Fisher Scientific）的ABI-PRISM 7700序列检测系统，通过实时定量PCR对SOCS3 mRNA表达进行定量。 SOCS3的引物对如下。

正向，5'-CTGGACCCATTCGGGAGTTC-3'。

反向5'-AACTGGGAGCTACCGACCATTG-3'。

将SOCS3 mRNA的相对量标准化为18S rRNA。

2.5 AC检测和Rap1激活检测

如前所述[20,21]测量AC活性。使用Active Rap1下拉检测试剂盒（Thermo Scientific）根据制造商的协议进行了一些修改，测量了Rap1的活性。简而言之，将heart组织在Polytron中匀浆，超声处理并以5400 * g离心15分钟。将上清液与融合到谷胱甘肽S-转移酶盘的Rap1结合结构域RalGDS-RBD一起温育。重复洗涤步骤后，通过在SDS样品缓冲液中煮沸从磁盘上除去结合的GTP-Rap1，并使用Rap1抗体通过免疫印迹进行分析。

2.6 实验动物模型

使用人Epac1 cDNA和小鼠α-肌球蛋白重链启动子（Epac1TG）开发了具有heart特异性Epac1过表达的转基因小鼠[22]。所有实验均在4至6个月大的雄性Epac1TG小鼠和非转基因对照小鼠（NTG）中进行。最近报道了性别特异性的不同心肌机制是对LPS的heart功能障碍的基础。在雄性小鼠中，败血症诱导的heart功能障碍是由于心肌钙离子处理失调而发展的。相反，在雌性小鼠中，LPS介导的heart功能障碍位于Ca2 +处理的下游，可能涉及肌丝Ca2 +敏感性降低[23]。因此，我们使用雄性小鼠进行本研究，以确保与以前的工作具有可比性[2,24]。

根据日本组织动物保护和管理法（第105号）和《横滨市立大学医学院动物实验指南》对动物进行护理和治疗。横滨市立大学医学院动物保护与使用委员会批准了所有动物研究。

2.7免疫组织化学分析

将左心室在4％的PBS（pH 7.4）中的4％低聚甲醛中固定16小时，并包埋在石蜡中。将切片（4μm）用二甲苯和梯度乙醇脱蜡，然后在0.3％H2O2的甲醇溶液中孵育30分钟以灭活内源性过氧化物酶，然后分别用PBS冲洗3次，每次5分钟。将组织在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中于100℃孵育10分钟，在5％脱脂牛奶中于室温封闭30分钟，然后在湿润的小室中于4 C与以下抗体一起孵育过夜：anti-Epac1和反SOCS 3。将组织在PBS中清洗3次，每次5分钟，然后根据制造商的说明使用ABC试剂盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA，美国）进行处理。用3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（DAKO，Glostrup，Denmark）或荧光素观察免疫复合物。用Nikon EC（Nikon，Tokyo，Japan）观察荧光信号。在这两种情况下，核均用苏木精或碘化丙锭复染。

2.8 LPS注射和生理学研究

给小鼠腹膜内（ip）注射溶解在300μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的大肠杆菌055：B5 LPS（5 mg / kg）[25]。对照小鼠仅接受300μLPBS（ip）。 LPS注射后6或24小时，腹膜内注射2.5％三溴乙醇（0.010至0.015 mL / g体重）麻醉小鼠。如我们先前所述[20,26]，进行了超声心动图测量和侵入性血流动力学测量。使用输液泵[20]静脉输注ISO（0至0.40μg/ kg / min，持续5分钟）。

2.9细胞因子的Bio-Plex测量

血清细胞因子水平，例如白介素6（IL-6），IL-1β，IL-10，IL-17，干扰素-γ（IFN-γ），角质形成细胞趋化因子（KC），单核细胞趋化蛋白1（使用多重悬浮液阵列（Bio-Plex，Bio-Rad，Hercules，CA，MCP-1），MCP-1（受激活后调节，正常T细胞表达和分泌（RANTES）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））进行测量美国）在磷酸盐缓冲液（PBS）和LPS处理的NTG和Epac1TG中使用。

2.10 休息后电位的测量

在孤立的右心室带中测量心肌收缩力。准备工作是由1 Hz的电场刺激驱动的，等轴测记录了所产生的张力。休息后增强被用来评估heartCa2 +的处理和收缩功能，被测量为休息15或30 s后第一次收缩的增强[27]。暂停后收缩力的增强表示为同一制剂中Ca2 +浓度升高（8至10 mM）引起的收缩力最大增加的百分比。

2.11 腺病毒构建

使用AdenoX腺病毒构建试剂盒（Clontech，东京，日本）产生编码全长人Epac1的腺病毒载体（由J.L.Bos博士供给）。编码LacZ的腺病毒载体被用作对照[28]。

2.12 统计分析

所有数据均以S.E.M.当考虑2个样本时，使用Student t检验进行数据比较；对于3个或更多样本，进行方差分析，然后进行Bonferroni后测。当P ＜0.05时，差异被认为是显着的。

3.结果

3.1小鼠heart特异性Epac1过表达

为了检查Epac在完整动物中调节heart功能的作用，我们在α-heart肌球蛋白重链启动子（Epac1TG）的控制下生成了过量表达人Epac1基因的转基因小鼠。与非转基因对照小鼠（NTG）相比，Epac1表达量增加了11倍（n = 4，P <0.0001）（补充图S1A）。

进行了Rap 1激活测定，以证实Epac1TG中Epac1过表达的有效性。我们发现，与野生型对照相比，过表达的人类Epac1显着增加了Rap 1的激活（n = 4，P <0.01）（补充图S1B）。由于内源性Epac1和Epac2在WT和Epac1TG的heart中均类似表达，因此Rap1激活的增加很可能以heart特异性方式反映了人类Epac1过表达的影响。我们还进行了免疫组织化学分析，以鉴定Epac1的亚细胞定位（补充图S1C）。 Epac1不仅在细胞质中发现，而且在NTG的核区域中也发现。这些发现与先前在培养细胞中证实的发现一致[19]。 Epac1TG中Epac1的分布相似，但染色较浓。

由于Epac1的过表达可能会改变cAMP信号传导中其他分子的表达，例如PKA亚基，因此我们检查了β1-AR，β2-AR，β-AR激酶（βARK），Gsα，Gβγ，Giα，类型的蛋白表达除PKA亚基外，还通过western blotting获得5/6 AC（补充图S2A）。这些分子在NTG和Epac1TG之间的表达没有差异。我们还检查了Epac1TG中cAMP产生的变化。 NTG和Epac1TG中的基础和刺激AC活动相似，这表明在Epac1TG中cAMP的产生没有改变（补充图S2B）。这些发现表明，Epac1TG小鼠在heart中表现出Epac1特异的过表达，而PKA含量或cAMP产生没有变化。

3.2在Epac1TG麻醉下通过超声心动图评估

Epac1TGheart肥大的发展（表1）.NTG和Epac1TG显示相似的心室大小（左心室舒张末期直径; LVEDD和左心室收缩末期直径; LVESD） ）和收缩力（左心室射血分数； LVEF）（表1）。此外，NTG和Epac1TG之间对输注异丙肾上腺素（ISO）攻击的LVEF反应无差异（补充图S2C）。其他研究者已经证明，Epac可诱导培养细胞的心肌肥大[29,30]。因此，我们检查了Epac1TG中heart肥大的程度。在Epac1TG中，LV重量（LVW; mg）/胫骨长度（TL; mm）比略有增加，但显着增加（NTG对Epac1TG：4.3±0.1对5.0±0.1 mg / mm，n = 12，P <0.01）。 LVW /体重比是heart肥大的另一个指标，显示出类似的增加（表1）。

表1 heart大小和heart功能。数据为平均值±SEM，功能数据为麻醉下。 LVW：LV重量。体重：体重。LVEF：左心室射血分数。LVEDD：LV舒张末期直径。LVESD：LV收缩末期直径。％FS：％缩短百分比。 * P ＜0.05，** P ＜0.01。

众所周知，β-AR信号的激活有效地增强了heart的收缩力，这是通过PKA实现的[31]。但是，我们的研究结果表明，Epac在体内过度表达时，至少在基础和生理条件下不能调节heart收缩力。相反，Epac1过表达引起轻微的heart肥大。我们还检查了NTG和Epac1TG在2个月，5个月和12个月时的heart肥大（LVW /体重比）（补充图S3）。 2个月时NTG和Epac1TG的LV重量/体重比相似。但是，在5个月和12个月时，Epac1TG的血脂显着高于NTG。另一方面，在5个月和12个月时，Epac1TG与NTG相比，heart肥大的程度相似，这表明在5个月时（本研究的时间点），heart肥大可能会饱和。

3.3 LPS引起的heart功能障碍的变化

脂多糖（LPS）诱导的小鼠heart功能障碍是建立良好的模型，可检查促炎性细胞因子在heart功能障碍发展中的作用[32]。我们还发现LPS（5 mg / kg）在小鼠中引起LV功能（LVEF）的强烈恶化。 LPS注射后30分钟这种恶化很小（数据未显示），但在6小时达到最大，然后在24小时逐渐恢复到基线（图1A）。在NTG和Epac1TG中均发现heart功能障碍。然而，就左室射血分数的降低而言，功能障碍的程度在Epac1TG（19±2.1％）中明显小于NTG（36±2.4％，P <0.01，n = 8-16）（图1A）。 LVESD，LV功能的另一个指标，在Epac1TG中也明显小于NTG（NTG与Epac1TG：3.6±0.1对3.1±0.07 mm，n = 9-14，P <0.01）（图1B）。血流动力学测量表明，LPS注射后6 h，NTG中的最大dP / dt显着降低（图1C），最小的dP / dt显着增加（图1D）（n = 5 -18，P <0.001）。然而，在Epac1Tg中，最大dP / dt和最小dP / dt的变化幅度明显较小（n = 5-18，P <0.01）（图1E）。这些发现表明，Epac1过表达使内毒素诱导的收缩期心肌功能障碍中的heart功能障碍的程度最小化。如补充图4所示，LPS注射后6 h Epac1表达没有明显变化。尽管用LPS治疗的小鼠表现出虚弱，嗜睡和立毛，但根据以前的发现，使用类似剂量的LPS（6 mg / kg），野生型和Epac1TG的死亡率均为<10％[32]。

图1  Epac1TG注射LPS后左心室功能的变化。注射LPS后，对左心室射血功能（LVEF）（A）和LV收缩末期直径（LVESD）（B）进行超声心动图测量。（A）在注射LPS后0、6和24小时测量的LVEF。在6 h时，Epac1TG的heart功能障碍程度明显较小（n = 8-16，## P <0.01 vs NTG，++++ P <0.0001 vs NTH 0 h，P <0.001 vs Epac1TG 0 h ，2向方差分析）。（B）LPS注射后0和6小时测得的LVESD。基线时，LVG在NTG和Epac1TG之间无显着差异（n = 5-7，P = NS，与NTG无关）。 LPS注射后6小时，Epac1TG中的LVESD显着低于NTG中的LVESD（n = 5-14，** P <0.01相对于NTG，2次方差分析）。（C-E）LV功能的有创血液动力学测量。在Epac1TG和NTG注射LPS后0和6小时，比较了最大dP / dt（C），最小dP / dt（D）及其相对于基线的变化（E）。 LPS注射后6 h Epac1TG的降低幅度明显小于NTG（E）（n = 5-8，** P <0.01，2-方差分析）。

3.4 Epac1TG中Jak-STAT信号减少而SOCS3增加

我们最近证明，在接受LPS处理的动物中，血清中IL-6含量升高[33]，IL-6激活了培养的心肌细胞中的Jak-STAT途径，而该主要细胞因子途径的激活被8-CPT-AM（一种Epac选择性cAMP类似物[17]。因此，在目前的工作中，我们检查了LPS处理的Epac1TG和NTGheart中STAT3和STAT1的磷酸化。NTG和Epac1TG中STAT3和STAT1的总量相似。在NTG和Epac1TG中，酪氨酸705（Tyr705）（图2A）上的STAT3和酪氨酸701（Tyr701）上的STAT1（图2B）的磷酸化水平也相似，并且在基线时最低。但是，LPS注射后6小时，STAT3和STAT1的磷酸化均显着增加（图2A，B）。 STAT3（NTG对Epac1TG：100±14对56 8％，n = 6-9，P <0.01）和STAT1（NTG对Epac1TG：100±13对62±10％）在Epac1TG中的增加幅度明显较小。 ，n = 5-8，P <0.01）。注射后24小时，STAT1磷酸化水平降至基线水平，而与基线水平相比，NTG和Epac1TG中STAT3磷酸化水平仍然升高。此外，我们发现，经蛋白质印迹（图2C）和免疫组织化学（图2D）证明，与NTG相比，LPS处理的Epac1TG中SOCS3的蛋白表达更高。

图2 注射LPS后Jak-STAT通路的变化。在LPS注射后0、6和24小时，比较Epac1TG和NTG之间STAT3（A）和STAT1（B）的总磷酸化量。（A）在NTG和Epac1TG中，酪氨酸705（Tyr705）上的STAT3磷酸化在6小时时显着增加。 Epac1TG在6 h时的增加幅度明显较小（n = 6-9，** P <0.01，2-方差分析）。显示了代表性的免疫印迹。（B）酪氨酸701（Tyr701）上的STAT1磷酸化也以类似方式上调。 Epac1TG的增加幅度明显较小（n = 5-8，** P <0.01，2-方差分析）。每次测定中，LPS注射后6小时在NTG中的表达量取100％。显示了代表性的免疫印迹。（C）SOCS3蛋白表达的变化。 PBS或LPS注射后6小时，通过Epac1TG和NTG中的Western blotting检测SOCS3蛋白的表达。 LPS处理的Epac1TG中的SOCS3蛋白表达明显高于NTG。通过LPS处理，Epac1TG中SOCS3的表达显着上调（n = 6-10，* P <0.05，2-way ANOVA）。在每次测定中，将PBS处理的NTG中SOCS3蛋白表达的量设为100％。（D）LPS注射后6小时的SOCS3的免疫组织化学染色。箭头指示心肌或血管中SOCS3阳性区域。所有图片都是在相同条件下进行的三个独立实验的典型结果。比例尺：50μm。（E）通过蛋白质印迹比较LPS注射后6小时在Epac1TG和NTG中的iNOS蛋白表达。在基线时，NTG和Epac1TG中都几乎检测不到iNOS蛋白在heart中的表达。注射LPS后6小时，iNOS蛋白表达上调，但NTGheart的增加幅度远大于Epac1TG（n = 4，* P“ <0.05，Student's t检验）。每次注射LPS后6小时，NTG中iNOS蛋白表达的百分数均为100％。

3.5在Epac1TG中iNOS表达降低

我们最近发现，IL-6在体外培养的心肌细胞中可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达呈时间依赖性增加，而这种增加被8-CPT-AM的治疗显着抑制[17]。因此，我们接下来研究了LPS注射后iNOS在NTG和Epac1TG中的表达。

在基线时，在NTG和Epac1TG中几乎检测不到iNOS表达。在LPS注射后6小时，两种类型的小鼠中iNOS表达均增加。但是，NTG的增加幅度明显大于Epac1TG（NTG与Epac1TG：100±11对66±8％，n = 4，P <0.05）（图2E）。因此，LPS处理的Epac1TG中iNOS表达的增加减少了（相对于LPS处理的NTG，减少了34±8％），最有可能通过SOCS3的上调（相对于LPS-处理，减少了166±7％）。处理的NTG）和抑制STAT3磷酸化（Tyr 705）（相对于LPS处理的NTG抑制了44±8％），从而保留了heart功能。

3.6血清促炎细胞因子水平的升高是相似的

已知LPS注射会增加血清中的细胞因子水平，包括IL-1β，IL-6，IL-10，IL-17，干扰素-γ（IFN-γ），角质形成细胞趋化因子（KC），单核细胞趋化蛋白- 1（MCP-1），受激活后调节，正常T细胞表达和分泌（RANTES）和TNF-α[34,35]。我们还发现，LPS注射后6小时，NTG和Epac1TG中所有这些细胞因子均显着增加。但是，NTG和Epac1TG的增加幅度相似（补充图S5），表明heart中Epac1的过表达不会改变这些细胞因子的释放。

3.7 Epac1TG注射LPS后休息后增强的变化

为了检查iNOS表达增加的功能后果，我们检查了15秒和30秒的休息间隔后Epac1过表达对休息后增强的影响。这种方法通常用于评估iNOS介导的肌浆网功能障碍和Ca2 +处理失调介导的负性肌力作用[36]。我们比较了基线时和LPS注射后6 h NTG和Epac1TG之间分离的心肌的休息后增强作用（图3）。在基线时，在NTG和Epac1TG的心肌中都观察到休息后第一次收缩的增强。在15s和30s后，在NTG中LPS注射后，增加的幅度明显变小，但在Epac1TG中保持不变。因此，当Epac1过表达（Epac1TG）时，不存在iNOS在NTG中表达引起的休息后收缩的减弱[36]。

图3 Epac1TG注射LPS后的休息后增强作用的变化。（A）基线（对照； PBS处理）和LPS注射（LPS）后6 h，在NTG和Epac1TG中的15s休息间隔后，休息后增强的代表性迹线。（B）静息间隔15 s（PBS对LPS 135±13.6对比92±10.5％，学生t检验）以及静息间隔30 s（PBS）后，NTG中LPS注射后6 h休息后增强显着变小 与LPS相比：143±12.0对101±10.3％，n = 6，* P <0.05，Student's t检验），但在Epac1TG中保持不变。 暂停后收缩力的增强表示为Ca2 +浓度升高（8-10 mM）引起的收缩力最大增加的百分比。

3.8 Epac对响应IL-6的Jak-STAT通路的激活的影响

尽管交感神经系统和促炎细胞因子信号传导在心力衰竭的发展中起着重要作用，但人们对它们的相互作用仍然知之甚少。最近，我们证明IL-6是STAT3最主要的激活剂，并且IL-6介导的STAT3激活通过诱导心肌细胞中iNOS的作用降低了ISO诱导的细胞内Ca2 +的增加和heart收缩性[17]。因此，我们研究了Epac对心肌细胞中IL-6信号传导的影响。我们首先研究了在磷酸二酯酶（PDE）抑制剂3-异丁基-1-存在下腺苷酸环化酶（AC）激活剂福司高林（10μmol/ L）的作用。甲基黄嘌呤（IBMX; 0.2μmol/ L），发现IL-6诱导的STAT3磷酸化显着减弱（图4A）[37,38]。该结果表明，细胞内cAMP升高是β-AR活化诱导的信号转导的关键过程，抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化。此外，腺病毒介导的Epac1过表达增强了cAMP积累对IL-6诱导的STAT3磷酸化的抑制作用（图4B，C）。

图4 细胞内cAMP积累和腺病毒介导的Epac1过表达对IL-6诱导的STAT3磷酸化的影响。（A）用IBMX和福司可林预处理新生大鼠心肌细胞5小时，酪氨酸705上的IL-6介导的STAT3磷酸化显着抑制了30 3.1％（n = 6，** P b 0.01，1次方差分析）。（B）腺病毒介导的新生大鼠心室心肌细胞中Epac1的过度表达（2 MOI和10 MOI）。（C）腺病毒感染后24小时，通过蛋白质印迹法检查新生大鼠心室心肌细胞中IL-6诱导的酪氨酸705上的STAT3磷酸化。 用IBMX和毛喉素预处理新生大鼠心肌细胞5小时，腺病毒介导的Epac1过表达Epac1（2 MOI和10 MOI）以Epac1表达水平依赖的方式抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化（27的MOI抑制为10.6％） 2，（NS），MOI为10时为40 7.9％，* P b 0.05，n = 6，1路ANOVA）。

3.9通过PKCα的Epac介导的SOCS3表达

我们最近报道，心肌细胞中通过磷脂酶C（PLC）/蛋白激酶（PKC）的Epac激活可增加Jak-STAT通路的负调控因子SOCS3的表达[17]。因此，我们研究了在用ISO（10μmol/ L）的β-AR刺激或在福斯高林（10μmol/ L）的AC刺激下，用siRNA沉默Epac1对SOCS3 mRNA表达的影响（图5A，B）[38， 39]。 Epac1的抑制在基线时不改变SOCS3 mRNA的表达（对照siRNA与Epac1 siRNA：100±6.0对98±7.5％，P <0.01，n = 5）（图5B，左）。然而，经ISO刺激后，转染阴性siRNA的细胞中SOCS3 mRNA的表达远高于转染Epac1 siRNA的心肌细胞（对照siRNA与Epac1 siRNA：163±9.0对94±10.2％，P <0.01，n = 5每个），表明cAMP / Epac1途径可能在SOCS3的诱导中起作用（图5B）。

图5 cAMP / Epac1激活通过心肌细胞中的PKCα增加SOCS3的表达。（A）在培养的心肌细胞中抑制Epac1。以β-AR（ISO，10μM）和AC催化单元（Fsk，10μM）的水平进行刺激。用20nMsi Epac1和阴性siRNA（si对照）转染新生儿心肌细胞。转染后24小时，通过实时PCR定量检测基线和有ISO或Fsk存在的心肌细胞中Epac1mRNA的水平（** P b 0.01与si对照，n = 4-5）。（B）在基线（左）和存在ISO（10μM;中）或Fsk（10μM;右）的情况下，通过实时PCR定量心肌细胞中Epac1 mRNA的水平（** P <0.01 vs. si控制（n = 5）。转染后24 h，用无血清培养基洗涤心肌细胞，再孵育24 h，并用ISO或Fsk处理2 h。然后，通过实时PCR定量SOCS3 mRNA表达（** P b 0.01 vs si对照，n ＝ 5）。（C）在培养的心肌细胞中抑制心脏PKC的每种亚型（ε，δ，α）。用20nMsiRNA将新生儿心肌细胞转染到每个亚型的选定区域以及阴性siRNA（si对照）。转染后24 h，通过实时PCR定量每种亚型的mRNA水平（* P <0.01相对于si对照，n = 3）。（D）在用PKCɛsiRNA，PKCδsiRNA，PKCαsiRNA或si对照转染的新生大鼠心肌细胞中检测Epac介导的SOCS3表达24小时。转染后24 h，用无血清培养基洗涤心肌细胞，再孵育24 h，然后用8-CPT-AM（10μM）处理2 h。然后，通过实时PCR定量SOCS3 mRNA表达（** P ＜0.01，相对于si对照，n ＝ 9）。 8-CPT-AM处理后，在用阴性siRNA，PKCɛsiRNA或PKCδsiRNA转染的细胞中，SOCS3 mRNA表达显着且类似地增加。然而，在用PKCαsiRNA转染的细胞中其增加被抑制。在每次测定中，将在基线处用阴性si RNA转染的细胞中SOCS3的表达视为100％。

3.10 WP1066保护heart免受LPS介导的hear功能障碍的影响

（E）-3（6-溴吡啶-2-基）-2-氰基-N-（（SO-1-苯基乙基）丙烯酰胺）（WP1066）是一种Jak2抑制剂，已开发用于临床[43]。由于SOCS3抑制Jak并因此充当Jak-STAT途径的负调节剂，因此我们认为WP1066可能会抑制NTG heart 中的STAT3磷酸化，从而保护该器官免受LPS介导的功能障碍的影响。实际上，用WP1066（10 mg / kg ip）预处理1 h可以显着抑制LPS注射后6 h STAT3的磷酸化39 3％（n = 4-5，P <0.01）（图6A），而不会改变STAT1的磷酸化（n = 4）（图6B）.WP1066还抑制了LPS注射后iNOS的产生（LPS vs WP1066 + LPS：100 11.4 vs 51±6.8％，n = 6，P <0.01 ）（图6C）。相应地，就WP1066-治疗的NTG而言，就LVEF相对于基线的降低而言，heart功能障碍的幅度明显较小（WP1066 + LPS vs LPS：15 1.9 vs 26 2.0％，n = 5-6，P <0.01） ，表明抑制Jak2 / STAT3途径具有抵抗LPS介导的heart功能障碍的保护作用（图6D）。

图6 WP1066是一种STAT3抑制剂，可保护heart免受LPS介导的heart功能障碍的影响。比较了在LPS注射（5 mg / kg）之前用WP1066（10 mg / kg）预处理1小时对NTG中LPS注射后6 h STAT3（A）和STAT1（B）的总量和磷酸化的影响。（A）LPS注射后6小时，酪氨酸705（Tyr705）上的STAT3磷酸化增加，但用WP1066预处理的小鼠中STAT3磷酸化的幅度明显较小（n = 4-5，* P <0.01，两尾Student's t检验）。（B）在LPS注射后6小时，酪氨酸701（Tyr701）上的STAT1磷酸化也上调，用WP1066预处理不会改变磷酸化水平（n = 4，P = NS，二重学生t检验）。（C）注射LPS后iNOS表达增加，但在用WP1066预处理的小鼠中，增加的幅度明显较小（n = 6，* P <0.01，两尾学生t检验）。（D）用WP1066预处理1小时不影响heart功能。 LPS注射后6小时，用WP1066预处理的小鼠的heart功能下降要比不使用WP1066的小鼠小得多（n = 5-6，* P <0.01，1次方差分析）。

4 讨论

我们最近证明，Epac介导的SOCS3表达可通过抑制Jak-STAT通路和随后的iNOS产生来保护心肌细胞免受细胞因子介导的功能障碍[17]。在这项研究中，我们使用Epac1TG检查了这种情况是否也适用于体内。

我们发现，当heart 中Epac1过表达时，LPS诱导的小鼠heart功能障碍得到改善。由于过表达的Epac1（一种新的独立于PKA的传感器）本身并不能改善基础心功能，因此仅当心功能降低并伴有交感神经活动时，Epac的作用才会显现。几十年来，人们一直认为儿茶酚胺/ cAMP信号传导的主要靶点是PKA，而PKA介导的心肌细胞收缩力增加是补偿心力衰竭heart功能障碍的唯一机制。但是，我们的发现表明，还有另一种机制涉及Epac，至少在内毒素引起的收缩期心肌功能障碍中，它可以恢复heart功能。因此，与PKA不同，Epac在心力衰竭的发展过程中似乎在交感神经系统与促炎性细胞因子信号转导之间起着重要作用。

Jak-STAT通路以快速，短暂的方式被激活，并且在许多对细胞因子的生物学反应中起着至关重要的作用[44]。最近，已经发现了一个在负反馈回路中起作用的蛋白家族，该蛋白家族通过Jak-STAT途径调节细胞因子受体的信号传导，被称为细胞因子信号传导抑制因子（SOCS）[45,46]。 SOCS由八个相关蛋白家族组成（细胞因子可诱导的含SH2的蛋白和SOCS-1至-7），其中SOCS1和SOCS3的特征最为详尽。 SOCS1和SOCS3也可以通过非细胞因子刺激来诱导，从而提出了一种机制，通过该机制，其他途径不同的信号通路可以负面地控制细胞因子的响应性。最近发现的一种用于SOCS诱导的信号是细胞内cAMP升高[46]。最近的工作已开始阐明Epac的功能，在这里我们已经在基于内毒素血症的新生大鼠心肌细胞的体外模型中使用Epac1TG鉴定了Epac1介导的SOCS3诱导及其在体内的生理相关性。

关于SOCS3在心血管疾病中作用的先前研究发现不一致。安川等。结论认为，根据我们目前的发现，SOCS3可能是预防压力超负荷引起的heart功能障碍的新靶标[7]。另一方面，其他研究小组得出结论，heart特异性SOCS3缺失可能增强多个heart保护信号，以防止缺血引起的应激后heart重塑[47,48]。

据报道，通过重组细胞穿透性SOCS3的细胞内递送或基因转移技术手段诱导SOCS3可有效治疗全身性和局部性炎症综合征，如败血症或关节炎[49,50]。更重要的是，据报道，去甲肾上腺素的使用有利于败血性休克患者的预后。这些先前的发现以及我们目前的结果表明，外源去甲肾上腺素可能会激活heart中的cAMP / Epac途径并诱导SOCS3 [9,51]。因此，我们认为cAMP / Epac介导的heart保护作用与heart相反细胞因子/内毒素引起的损害，至少部分可以解释去甲肾上腺素的有益作用；因此，交感神经系统似乎可以通过多种机制调节heart功能。

我们先前已经证明，在PLC抑制剂（U73122）或PKC抑制剂（Ro-31-7549）存在的情况下，Epac介导的SOCS3诱导被消除，这表明Epac激活通过PLC / PKC增强了SOCS3的表达[17]。在本研究中，我们证明了用Epac1siRNA转染的心肌细胞中cAMP介导的SOCS3诱导被完全消除。我们还证明，Epac介导的SOCS3诱导在用PKCαsiRNA转染的心肌细胞中被消除，但在用PKCε或PKCδ转染的心肌细胞中没有改变。先前使用COS1细胞进行的研究表明，Epac介导的SOCS3诱导不是同种型特异性的，因为用任何heartPKC同种型转染的细胞中SOCS3诱导都减弱了[52]。这些结果以及我们以前的发现表明，Epac激活PLC /PKCα途径是心肌细胞中cAMP有效诱导SOCS3的关键条件。这与交感神经系统通过多种机制调节heart功能的想法是一致的。

Epac1有两种同工型（Epac1和Epac2），Epac1在heart和中枢神经系统中普遍表达[12]。重要的是，heart功能受中枢周围神经元网络相互作用的调节[53]，这表明CNS中表达的Epac1与heart中表达的Epac1协同在心功能控制中起着重要作用。小胶质细胞（大脑的固有免疫细胞）被认为在血脑屏障（BBB）的形成和体内稳定状态中起着至关重要的作用[54]。最近，据报道小胶质细胞不足导致败血症并通过激活IL-6 / STAT / iNOS途径改变血脑屏障，表明在小胶质细胞中表达的Epac1可能保护败血症中的BBB并保护heart功能，而不会改变中枢周围神经元网络的相互作用[55]。最近，对急性肝功能衰竭的内毒素耐受被证明可抑制Jak-STAT通路并随后诱导肝细胞中SOCS3的产生[56]。因此，我们认为内毒素血症中cAMP / Epac1途径可能通过抑制Jak-STAT途径在heart以外的许多器官中发挥保护作用。

Epac在肥厚展中的作用仍存在争议。尽管有报道指出Epac激活会引起heart肥大[30,57]，但其他研究并不支持这一假说[58,59]。在这里，我们发现Epac1TG小鼠显示出轻微但明显的heart肥大，表明心肌细胞中Epac1表达的增加导致体内心肌肥大的发展。

减弱的功能障碍不太可能反映Epac1TG中左室质量的增加，而不是反映Epac介导的防止功能障碍的特异性作用，因为我们以前的研究使用了从相同年龄大鼠制备的成年心肌细胞，表明Epac的激活减弱了抑制作用。 IL-6对异丙肾上腺素反应引起的细胞内Ca2 +浓度和收缩力增加的影响，表明Epac可以拮抗IL-6信号，从而调节Ca2 +瞬变和细胞收缩[17]。

腹膜内注射LPS还开发了许多先前研究中使用的败血症性心肌病的小鼠模型，所用LPS的剂量范围为4-50 mg / kg [32,60 64]。在那些研究中，即使注射LPS的剂量为N5 mg / kg，LPS注射后6-7 h的heart功能障碍仍很明显，并且其下降幅度与我们的小鼠模型相似[60,61]。此外，正如本研究中使用的小鼠模型所观察到的，即使LPS剂量为50 mg / kg，heart功能障碍在注射后24 h也会逐渐恢复至接近基线值[60,61,64]。更重要的是，已知在我们的模型中也被诱导的iNOS表达是内毒素血症heart功能障碍发展所必需的[24,60]。综上所述，这些结果表明本研究中使用的败血性心肌病小鼠模型是有效的，因此我们相信我们的发现表明Epac及其下游途径可能是内毒素血症heart功能障碍的治疗目标。

总之，我们已经证明，Epac介导的SOCS3蛋白表达通过抑制STAT3磷酸化和随后的iNOS产生来保护heart免受细胞因子介导的心功能障碍的影响（图7）。我们的研究结果还表明，Epac1及其下游途径（包括Jak2或STAT3）可能是治疗败血症性心力衰竭以及一般性心力衰竭的诱人靶标，因为细胞因子诱导的心功能障碍在糖尿病的发病机制中起着重要作用。心力衰竭[6]。

图7 与heart中的cAMP / PKA信号相反，cAMP / Epac信号的示意图模型。 PKA通过增强heart收缩力来增强heart功能。 相反，Epac1上调SOCS3蛋白表达，从而抑制Jak-STAT途径，从而抑制iNOS表达。 这种抑制作用可保护heart免受促炎性细胞因子和内毒素引起的功能障碍。

利益冲突：无。

披露：无。

鸣谢

参考文献：详见原文。

• 5.05 Epac1在转基因小鼠心脏过表达挽救脂多糖诱导的心功能障碍，抑制Jak-STAT通路.pdf(1401.15k)