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研究目的：

        与PD-1/PD-L1相互作用为靶点的免疫疗法的疗效对在基线时肿瘤微环境中出现T细胞炎症的患者更有利。因此，宿主和肿瘤因子调节启动内源性免疫和T细胞浸润到肿瘤微环境的程度，正被视为进一步提高治疗效果的机会。研究表明，共生菌群的组成可能会产生重大影响。

    这些结果促使我们对人类微生物菌群进行类似的分析，以了解抗PD-1对癌症患者的治疗效果。

拟解决的问题：

        探讨共生菌群组成与PD-1阻断免疫治疗的临床疗效

研究主要思路、方法及结果：

采用如下三种方法：

1）16s rRNA基因测序

        扩增子序列划分OTUs，在R和NR两组形成丰度差异；将OTU代表序列采用BLAST Search与NCBI数据库进行比对，以便于揭示潜在的种水平物种。

2）宏基因组测序

        通过将16S数据集的OTUs通过宏基因组鸟枪法测序显示的种水平物种进行匹配，进一步提高了种水平物种鉴定的可信度。

3）特定物种的qPCR

        对先前验证过的候选物种进行检测。

​BOX1：

        与16S分析相比，宏基因组测序结果显示R与NR中差异物种数量较少，但与16S分析结果中的物种相重叠。最大化候选物种数量进行筛选来处理这些分析，使用16S测序方法作为分析的起点。

（1）16S测序方法：

（2）宏基因组测序分析

        为了获得更精确的种水平特征，对相同的样本进行了宏基因组测序（42个样本中的39个样本可用）。Illumina Pair-end序列被分配到微生物分支，并分析与16S测序鉴定的63个OTU最接近的匹配。在最初的63个OTUs中，有43个被鉴定为潜在的匹配物种。

（3）特异物种的qPCR分析

        用于鉴定已筛选物种的一致性。

共生菌群与免疫治疗的临床反应之间的强相关性表明了一种潜在的因果关系，根据数据显示，小鼠肿瘤模型中的微生物菌群具有免疫增强作用。为了研究人类共生微生物增强抗肿瘤T细胞反应的能力，使用无菌（GF）小鼠作为受体。本团队曾报道过，通过从Jackson实验室获得的小鼠粪便微生物菌群进行移植，可以改善Taconic小鼠自发免疫介导的肿瘤控制。在建立当前模型的过程中，发现小鼠的B16.SIY黑色素瘤生长与无特定病原体（SPF）小鼠（均来自Taconic）的生长相似，用Taconic SPF小鼠的粪便定植GF小鼠并不影响生长率。结果表明，GF小鼠固有的自发免疫介导的肿瘤控制能力降低，使其适合于成为人源性微生物菌群的受体，从而有机会根据微生物菌群组成检测抗肿瘤免疫能力的提高。

     单靠粪便移植可以减缓肿瘤生长，这与先前的小鼠研究相似，在这些研究中，将来源于Jackson的粪便转移到Taconic小鼠体内，由于存在更有利的微生物菌群，足以产生部分疗效。

      用16s rRNA基因扩增子测序评估粪菌移植成功小鼠的细菌组成和对原始人类供体的一致性。

BOX3：

​        重点将放在A和B组小鼠上进行进一步机制研究。在肿瘤生长率和微生物定植方面，重复实验之间有很高的一致性（A1，A2和B1，B2）。

    为了确定肿瘤控制的差异是否归因于宿主免疫，对体外SIY应激脾细胞进行了IFN-g酶联免疫（ELISPOT）检测，结果表明，接种B16.SIY黑色素瘤细胞3周后，粪菌移植小鼠体内活化T细胞的频率增加。

    对肿瘤微环境的分析也显示，在这些小鼠中，SIY特异性CD8+T细胞的数量显著增加，而FoxP3+CD4+调节性T细胞的数量没有增加，这与肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的增加一致。

    抗PD-L1在R组菌群定殖的小鼠中明显有效，但在NR菌群定殖的小鼠中完全无效，表明共生菌群对体内免疫治疗效果有深远影响。

    用qPCR方法检测小鼠的粪便DNA，重述了我们对患者的分析结果。在患者验证的PCR反应中，6个种在菌群移植小鼠中重现，其富集模式与患者相同。

​Box4：

研究的意义与展望：

        虽然B.longum是目前研究中发现的一种共生菌，在小鼠模型中也发现它与免疫介导的肿瘤控制有关，但似乎多种特异性细菌可能有助于提高患者的抗肿瘤免疫。除了在应答者中出现过多的细菌外，一些OTU在非应答者中也频繁出现，先前在老鼠身上的研究表明，一些共生体菌群具有免疫抑制的潜力，例如通过诱导FoxP3+调节T细胞。此外，目前的队列研究表明，“有益”OTUs与“非有益”OTUs的比值是临床反应的最强预测因子。与有益细菌的频率越高，同时具有负面影响细菌的频率越低，两者相结合可能会获得最有利的临床效果。

        在本研究中发现的几种细菌在有应答和无应答的患者中的丰富差异，已经在体内检测了它们对GF小鼠宿主免疫应答的机制性影响。据报道，与其他细菌相比，在应答者中发现，E. faecium、C. aerofaciens、B. adolescentis和P. merdae导致外源的结肠调节性T细胞的频率降低。目前，发现应答者中的细菌更为丰富，Batf3树突状细胞（DCs）和辅助性T细胞1（TH1）反应的频率也增加。减少调节性T细胞、增加Batf3树突状细胞和增强Th1反应都有望改善免疫介导的肿瘤控制。尽管从复杂微生物菌群中推断这些结果应谨慎，但数据表明患者应答与细菌相关，可能对部分和系统的先天免疫和适应性免疫有明显影响。

        另外两项研究发现，在不同的实体癌中，共生微生物菌群与抗PD-1单克隆抗体的疗效有关。本方法在区分R和NR患者以及一些分析方法上有所不同。因此，应谨慎对待不同学术出版物中R和NR患者中丰度差异的共生微生物菌群的直接比较。尽管如此，关于微生物菌群对抗PD-1免疫治疗效果的机制影响存在一致意见，因为从R和NR患者到GF小鼠的粪便移植也可以重现患者的表型。

        除了微生物菌群外，其他肿瘤和宿主因素也会影响抗肿瘤免疫和癌症免疫治疗的疗效。内生肿瘤激活Wnt/b-环蛋白途径，以及Pten的缺失或突变已被证实导致T细胞向肿瘤微环境的浸润不足和抗阻断免疫治疗。免疫调节基因的种系多态性也有可能影响自发性抗肿瘤T细胞反应的程度。本研究描述的结果将共生微生物菌群组成与肿瘤基因组学和生殖遗传学整合成为一个多参数模型，以最大限度地预测哪些患者可能对免疫疗法（如，anti-PD-1）响应的能力开辟了一条途径。