干湿实验研究宫颈癌甲基化发5.8分SCI！
今天分享的是一篇2019年12月份发表在Signal Transduct Target Therapy（IF:5.87）上文章。
标题Integrative analysis of DNA methylation and gene expression identified cervical cancer-specific diagnostic biomarkers
DNA甲基化和基因表达的综合分析识别了宫颈癌特异性诊断生物标志物
摘要
宫颈癌是全世界癌症女性死亡的主要原因。本文对TCGA的Illumina HumanMethylation450K和RNA-seq数据进行综合分析，以识别宫颈癌特异性DNA甲基化标记。本文首先识别了差异甲基化和表达的基因，并研究了DNA甲基化与基因表达之间的相关性。使用宫颈癌在内的12种癌症的DNA甲基化图谱生成候选集，并采用机器学习技术来识别候选集中最终的宫颈癌特异性标志物。启动子甲基化与基因表达呈现负相关。在远距离调控基因表达中，高甲基化基因的甲基化更可能与基因表达负相关，而低甲基化基因的甲基化更可能与基因表达正相关。此外，使用TCGA数据进行十倍交叉验证，识别了四个宫颈癌特异性甲基化标记物cg07211381（RAB3C），cg12205729（GABRA2），cg20708961（ZNF257）和cg26490054（SLC5A8），其敏感性为96.2％，特异性为95.2％。这四个标记可以在GEO数据库的四个独立验证集中以94.2％、100％、100％和100％的AUC区分肿瘤与正常组织。此研究表明了甲基化标记物在宫颈癌诊断中的潜在作用，并可能促进新的表观遗传疗法的发展。
结果概述
1、 宫颈癌DNA甲基化的无监督聚类分析
将178例具有临床信息的宫颈肿瘤样本用于聚类分析。591个变异最大的DNA甲基化探针的一致性聚类识别了三个簇，分别被称为CIMP（CpG岛甲基化表型）高，CIMP中和CIMP低。20（11％），69（39％）和89（50％）个样本被聚类为CIMP高，CIMP中和CIMP低。并且发现三个临床特征（组织学，HPV状态、HPV种类）与这三个簇相关。如下图所示：
2、 差异甲基化和表达分析
在113个正常肿瘤样本和307个肿瘤样本之间，共有46040个CpGs发生甲基化。宫颈癌中有29730个高甲基化的CpG和16235个低甲基化的CpG。又分析了差异甲基化CpG（DMC）在各功能基因组区域中的分布。如下图所示：
在69个正常和304个肿瘤样本之间进行差异表达分析。共得到4949个差异表达基因（DEG），其中3096个上调基因和1853个下调基因。
3、 DNA甲基化对宫颈癌基因调控的影响
使用差异甲基化基因（DMG）和DEG之间的交集，进行DNA甲基化和基因表达的综合分析。许多研究表明，启动子甲基化会导致肿瘤抑制基因的失活，这是癌症发展的重要机制。根据DMG和DEG之间的交集，将基因分为四组：高甲基化表达上调（hyper-up），高甲基化表达下调（hyper-down），低甲基化表达上调（hypo-up）和低甲基化表达下调（hypo-up）。在2096个高甲基化基因中，有123个基因表达上调，601个基因表达下调。在1800个低甲基化基因中，165个基因表达上调，203个基因表达下调。对于下游标记物识别过程，本文集中于hyper-down基因，hyper-down基因的GO功能分析表明，大量基因参与化学突触传递，通过质膜粘附分子的同性细胞粘附，神经系统发育，谷氨酸受体信号传导途径和钾离子跨膜转运等功能。主要富集到神经活性配体-受体相互作用，昼夜节律夹带，钙信号传导，细胞粘附分子和逆行内源性大麻素信号传导等KEGG通路。甲基化和表达的相关性分析发现：在93,262个CpG基因对中，有323个（10％）基因显示出显著正相关，有2973个（88％）基因显示出显著负相关，而有83个（2％）基因显示出正相关和负相关（一个基因可以与CpG正反相关，因为一个基因在启动子区域可以包含多个CpG）。然后，作者研究了DNA甲基化对基因表达的远距离调节的影响。计算了差异表达和甲基化基因中的1092个CpG与4949个DEG之间的Pearson相关性。高甲基化基因的启动子甲基化更可能与基因表达负相关，而低甲基化基因的启动子甲基化更可能与基因表达正相关。如下图所示：
4、 宫颈癌特异性甲基化标志物的识别和验证
为了确定可靠的宫颈癌特异性甲基化信号，本文使用其他癌症的TCGA甲基化数据和机器学习技术严格筛选标记，流程如下图所示：
在2582个高甲基化低表达CpG中，排除了其它11种癌症中发现的2194个DMC。然后，对TCGA，GSE38266，GSE46306和GSE68339的样本中388 CpG进行层次聚类，通过基于信息增益和顺序后向特征选择（SBFS）的混合特征选择方法来进一步过滤候选标记。最终，作者识别了四个宫颈癌特异性标记，即cg07211381，cg12205729，cg20708961和cg26490054。这些CpG定位于四个不同的基因：RAB3C（cg07211381），GABRA2
（cg12205729），ZNF257（cg20708961）和SLC5A8（cg26490054）。然后，通过使用TCGA样本作为训练集建立了逻辑回归模型，并进行了十倍交叉验证。曲线下面积（AUC）为0.989，表明这四种标记物在区分TCGA宫颈癌和正常样本方面可以表现出优异的性能。如下图所示：
5、 GABRA2，ZNF257和SLC5A8在宫颈癌中弱表达
为了进一步研究四个高甲基化宫颈癌特异性标记物在人CSCC标本中的表达，我们使用93个人CSCC样本及配对组织，通过免疫组化（IHC）评估GABRA2，ZNF257，SLC5A8和RAB3C的蛋白质水平。最终发现CSCC细胞中GABRA2，ZNF257和SLC5A8的染色水平显著低于相邻正常细胞，而RAB3C的水平显示CSCC和正常细胞之间没有差异。结果表明，GABRA2，ZNF257和SLC5A8的高甲基化与这些基因在人CSCC细胞中表达的降低有关，这证明GABRA2，ZNF257和SLC5A8可能是人CSCC的新诊断标记。如下图所示：
本文逻辑清晰，运用机器学习方法筛选癌症标记，并进行了实验验证，在研究DNA甲基化与表达关系中值得我们学习。
