发帖
每发1个新帖
可以获得0.5个丁当奖励
回帖

紧急求助——AGE检测测方法 [精华]

只看楼主
页码直达：
直达末页

楼主

我是风儿

内分泌科

铁杆站友

1楼

这个帖子发布于15年零143天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

[Hidden Post:1]

您无权限看这个帖子，您的积分需要大于 1 如何获得积分？

2005-08-30 10:31 浏览 : 5289 回复 : 10

投票
收藏 7
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 乡镇卫生院入编制问题，请懂行的指点迷津，谢啦！

轻风和舞

常驻站友

2楼

你人才求助还要积分才能看

2005-09-21 09:38

投票
收藏
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 普放病例分享31：X线虽有不足但有用，请各位上眼

轻风和舞

常驻站友

3楼

我实验室用ELISA测AGE量

2005-09-21 09:39

投票
收藏
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 第一次临床实操，你还记得吗？

hansunist

内分泌科

铁杆站友

+1 积分
4楼

看不到你的问题内容，仅就题目回答。
AGEs的检测方法
由于AGEs化学结构具有多样性，对其在体内蓄积程度的检测有较大困难，而且目前尚无通用的测量单位，也没有能够被普遍接受和使用的检测方法，所以造成研究人员之间无法比较其实验结果，严重阻碍了对AGEs及其相关疾病的研究进展。
目前检测AGEs的常用方法有分子荧光分析、色谱分析技术、ELISA、放射免疫分析、放射受体分析、免疫组化技术等。现介绍这些方法及有关进展如下：
1.分子荧光分析
AGEs具有发射荧光的特性，因而可以用荧光分光光度计测定其荧光值从而反映AGEs在循环或组织中的水平。用于测定AGEs的激发光谱(Ex)为350～390 nm，发射光谱(Em)为440～470nm，化学结构不同的AGEs，其荧光光谱特征不同，荧光强度随AGEs浓度的增加升高。戊糖苷素（pentosidine）的特征性荧光光谱为Ex335nm/Em385nm；精氨嘧啶的特征性荧光光谱为Ex320/Em382nm；糖基化胶原（Collagen-AGE）特征性荧光光谱为Ex370/Em440nm。最近，Gopalkrishnapillai B等[10]测知糖基化血红蛋白（Hb-AGE）的特征性荧光光谱为Ex308/Em345nm，可以由此来测定其血清中的浓度，实验证明，该法测得的Hb-AGE值比用ELISA法所获得的结果更为合理。由于Hb-AGE在体内生成较HbA1c晚且半衰期长，所以将Hb-AGE作为一项监测血糖浓度的长期指标。当然，荧光光谱分析也有其局限性，一些AGEs没有荧光特性，如羧甲基赖氨酸（CML）,体内还存在其它荧光物质以及引起荧光猝灭的物质，这些都影响了分子荧光分析的应用范围。
2.色谱分析技术
色谱法是将多种物质混合试样通过色谱分离场作用分离成单一物质成分进行检测确定的分析技术，由于AGEs具有特定的电荷、分子量、化学性质以及物理性质，因此可以利用色谱法将AGEs与其它物质分离并进行定量分析。目前用于检测AGEs的色谱技术主要是高效液相色谱(HPLC)。Odetti P等[11]将糖尿病患者和尿毒症患者的血浆蛋白与血红蛋白盐酸水解后，再用反相高效液相色谱分析戊糖苷素，其实验结果也证明酸性水解过程中氧化产生的荧光物质是影响检测戊糖苷素准确性的主要因素，用阳离子交换柱进行再层析或者在无氧条件下水解可以消除这种影响。Wilker SC等[12]用高效液相色谱检测糖尿病患者血清和晶状体蛋白中的精氨嘧啶、戊糖苷素，发现其中精氨嘧啶比戊糖苷素含量高10～25倍，糖尿病患者血清蛋白中的精氨嘧啶浓度比非糖尿病对照组高2～3倍(9.3 +/- 6.7 vs 4.4 +/- 3.4 pmol/mg)。
最近，有研究者将一种氨基酸分析方法用于检测分析AGEs。6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC)是一种新型衍生剂，氨基酸可与之反应产生稳定的衍生物，这种物质具有强荧光特性，因而可用高效液相色谱进行分析。Ahmed N等[9]将AGEs修饰蛋白质的酶或酸水解产物与AQC反应后用高效液相色谱分析，较全面地分析体外产生的糖基化蛋白所包含的AGEs（hydroimidazolone、MOLD、DOLD、GOLD、CML、CEL、THP、pyrraline、argpyrimidine、pentosidine等），并证明了氢化咪唑酮（hydroimidazolone）存在异构体现象。但该法尚不成熟，目前还不能检测和分析体内产生的AGEs。
高效液相色谱具有高效、高灵敏度、高分辨率的特点，这在分析AGEs的结构方面有其独到之处，但其操作过程烦杂、耗费昂贵不利于应用到临床检验。
3.ELISA法
近年来，已有大量文献报道用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测AGEs，其原理是通过待测抗原、固相抗原与特异性抗体的竞争结合来反应待测抗原的水平，结合到固相抗原上的抗体量与待测样品中AGEs的量呈负相关。ELISA具有敏感度高、特异性强、操作简单、观察结果容易的特点，是一种颇为理想的微量测定技术。
目前ELISA检测AGEs的方法主要有直接法和竞争法两种，其中竞争法应用最为广泛。ELISA法在检测AGEs的应用中存在的主要问题是没有统一的标准方案。这有多方面的原因：AGEs的化学结构复杂多样、没有制备抗体的标准方法、没有统一的计量单位等等。为使不同实验室或不同批次所测得的AGEs具有可比性， Mitsuhashi T等[13]提出用正常人血清(NHS)来标准化AGEs检测。因正常人血清中可测到AGEs而且其水平处在狭窄范围，所以可用正常人群血清平均AGEs值作为测定AGEs的通用标准。NHS法所定义的AGEs单位为：在竞争性ELISA中1UAGEs等于1：5稀释的NHS所抑制的AGEs的量，即NHS中AGEs量定为5U/ml。该法所定义的AGEs值还可以应用于AGE修饰蛋白质，表达为AGE U/μg 蛋白，如此则不同实验室、不同检测方法所制备的AGE修饰蛋白就可以标准化。
尽管NHS法提供了一个AGE标准单位，但ELISA中使用不同的抗体依然导致不同的检测结果，这也从另一个方面反映出作为免疫原的AGEs具有复杂多样的抗原表型结构。目前制备抗体多使用体外制备的AGE修饰蛋白质作为免疫原和ELISA中的固相抗原，常用的有AGE修饰人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶(RNase)、溶菌酶(Lysozyme)、钥孔青贝血蓝蛋白(Key-hole limpet hemocyanin，KLH)等，其中以AGE修饰核糖核酸酶免疫动物所产生的抗体效价高，特异性强。AGE修饰蛋白质免疫动物（多采用家兔）后采血分离血清可得抗AGE多克隆抗体。制备单克隆抗体的大致过程为[14]：AGE修饰核糖核酸酶免疫Balb/c小鼠，然后将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，筛选出只对某种AGE结构（如CML）反应的亚克隆细胞，将这种细胞植入小鼠腹腔进行繁殖，分泌抗体，最后用吸附色谱法将腹水中的单克隆抗体分离纯化。目前制备成功的单克隆抗体有识别CML的6D12、识别CEL的KNH-30、识别荧光交联素(fluorolink)的IF6、识别某种非CML的2A2和3A3等[14,15]。单克隆抗体具有高度的特异性和专一性，因此可以用于专一研究某种AGE结构及其功能。
研究证明，AGEs作为免疫原可以在体内产生自身抗体并形成免疫复合物，从而影响ELISA法对循环中AGEs的检测结果[7]。
4.免疫组织化学法
免疫组织化学法是利用抗AGEs单抗或多抗对组织中AGEs的分布进行定位检查。该法检测AGEs首先要获得组织标本，操作过程繁杂，而且只能做定性检测，这些缺点限制了其在临床工作中的应用。目前免疫组织化学法主要用于AGEs相关疾病发病机制的研究。Xia Ling等[15]用免疫组织化学法在胎鼠的外胚层、中胚层、内胚层细胞均发现CML、CEL及2A2抗体阳性物质，并且这些AGEs物质在胎鼠组织和细胞中的沉积量随胎鼠的发育呈上升趋势。
5.放射免疫分析
将某种AGE修饰蛋白质免疫新西兰肉兔，制得特异的抗AGE抗体，通过样本中未标记AGE与125I标记AGE与抗体竞争性结合而测定样品中该种AGE的量。这种通过与同位素标记抗原竞争结合特异抗体而达到检测样品中某种特殊AGEs含量的放免法的特异性和灵敏度均较高，但标记抗原的同位素放射强度随时间衰减，造成检测结果的批间差异较大，重复性不够好。
6.放射受体分析
AGEs特异结合受体存在于许多细胞（如单核－巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等）表面，故可通过放射受体分析法来检测AGEs水平。Makita等[16]将一种巨噬细胞样肿瘤细胞株RAW264.7培养后，用于竞争性放射受体测定，体外制备的AGE－BSA用125I标记后用作模型配基（model ligand）与待测样品中AGEs竞争结合细胞表面的AGEs受体。1U的AGEs定义为能够使125I标记的AGE-BSA与RAW264.7细胞上AGEs受体特异性结合抑制50％的待测AGEs的量。
该法敏感性、特异性均较高，但目前应用报道并不多见，主要因为其操作需培养细胞，耗时费力，而且结果受同位素衰变影响大，稳定性和重复性差，故很难推广应用。
7.其它方法
近来，质谱技术逐渐应用于AGEs检测，如气相色谱质谱法(GC-MS)、高效液相色谱质谱法(HPLC-MS)以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)等。Kislinger等[17]用MALDI-TOF-MS检测Amadori产物、CML和咪唑酮A(imidazolone A)，将AGE-Lysozyme通过蛋白内切酶Glu-C酶切用Biflex III MALDI-TOF-MS检测，获得肽质量指纹谱，与蛋白数据库比较后，可以获知蛋白质的糖基化位点。MALDI-TOF-MS不能做绝对定量分析，仅能做相对量化分析，但在分析分子质量方面有独特的优势，又具有可以同时分析多个不同AGEs的优点。
Lin Chuai-Yu等[18]提出用光散射免疫测定法(light-scattering immunoassay)可以进行大规模血清AGEs测量。该法具有操作简便、样品量小、快速、精确的优点，且不受血红素、胆红素、甘油三酯(<500mg/dl)、胆固醇(<320mg/dl)的影响。

2005-09-24 15:26

投票 1
收藏 5
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

• 一天上报八次体温，真正有体温计的人有几个？

内分泌

紧急求助——AGE检测测方法 [精华]

提示

丁香园旗下网站

关于丁香园

官方链接

内分泌

分享到：

微信扫一扫

紧急求助——AGE检测测方法 [精华]

微信扫一扫

微信扫一扫

微信扫一扫

微信扫一扫

提示

丁香园旗下网站

关于丁香园

官方链接