老话重提，统计图，和科研领域里的大多数图像数据伴生，是一种大家喜闻乐见的，直观表现数据结果的形式。

当您需要对单张染色图特定区域进行分析时您仍然可以使用这个软件。正之前所说的，它非常强大：你想怎么处理数据，只要你愿意，都可以如愿以偿。这次的教学目的就是您画一个特定区域，指定一个特定通道，让软件帮你计数！

下面再次向大家介绍这款十分有用的软件 Imaris，可以轻松地帮你统计指定区域的细胞数目，并且计算相关共定位的数据。一起来看看吧。

1. 打开软件，出现一个含有标题栏（包含 File,  Edit,  View,  Image Processing 等标题）及工具栏（Open 栏，Slice, Surpass 工具），及左右两侧各一个窗口。

这时我们可以打开 Edit>（下图）栏。

这个栏目的功能是调节荧光图片的各种参数，你也可以使用【Ctrl+D】 的快捷键调出这个调节窗口。

2. 打开您的荧光图片：直接将图片拖入这个软件的界面，或者在 Open 寻找图片文件所在的目录，打开它！如下图，您会发现之前的 display adjustment 口自动填入了已打开图片的通道参数。

Tips: 如果您并不需要对荧光图进行统计分析，只想输出一张相比原图更美观合法的可 publish 图，这个窗口就够用了。您可以通过拖动单个通道的靠右上角的小三角符号调节通道的荧光强度，往左边移动，亮度变强；调节左上侧的小三角符号可以调节通道的背景，往右，背景变低；中下的小三角形有类似的效果。所以这个窗口可以用来美化你的荧光图，之后 Save as 可以输出一张美美的图了。

3. 回归正题！在分析过程中，我们可能要针对不同组织部位分别进行分析，那么我们就要用到 surface 这个功能，利用它，我们可以将组织分割成不同的部分分别分析。

例如这副图，按照蓝色通道（细胞核染色通道）的密度对这块组织进行分区，我们大致可以分三块（致密区 1 - 稀疏区 2 - 致密区 3 ），我们暂时忽略这些结构的意义，只讲一下如何把这个操作完整进行下去：在 Display 窗口点掉前三个通道前面的对勾，只剩下最后一个通道，显示如下：

4. 为了画 surface , 将右边缩略图关掉，在整个界面最右下角点击即可；

点击 surface 按钮 (已经学过第一堂课的童鞋，在 spots 后面一个可以找到 surface, 如红框所示)，你看见左边的任务栏多了一个 surface 1，点击 Skip automatic creation,  edit manually。

5. 准备画 surface ：在上述操作后，会跳出来 surface 界面各种操作按钮，点击 Draw（黄圈处）开始画吧（哦，如果你是首次操作整个软件，你要在右边 pointer 区域选择 Select, 这样你的鼠标左键才可以在图片上被激活）再点击 Draw。机灵的可以看见，我已经把 Surface 名字改了（双击可以改名字的哦）

6. 开始画，鼠标左键点断时绘制一个完整的圈。之后点击（Draw 后边的）Create surface

7. 接下来我们将在这个 surface 进行计数操作。如红色箭头，点击 Mask surface, 在弹窗里选择想要在这个区域计数的荧光通道（如我选择了绿色通道），勾选 duplicate 选项（这样将来的 surface 的单个通道会被单独复制出来）

8. 如红框所示，Display 窗口里多出来了一个荧光通道 ——Masked ChS1-T3（就是刚才被单独复制出来的）。

9. 勾选掉致密区一这个 surface，只勾选这个新建的通道，您会发现整个图只剩下指定区域的指定荧光通道的信息，这样我们通过在这个特殊通道点击 Spots, 进行统计即可。

10. 大概回顾一下计数过程：

a. 点击 Spots, 新建了一个 Spot 事件（重命名为致密区 1 的 GFP+ 细胞）点击下一步（底部的向右的小三角形）

b. 选定 Channel5-(一定要选这个呀，这样统计出来的才是刚才设定的区域内的结果)

c. 点击右下角的小三角箭头，完成这次计数。

d. 你如果对计数结果不是 100% 满意，可以在手动调一下，最终在【曲线标识】(如红框) 中可以看到统计的数据。

e. 针对这个区域的细胞共定位进行统计分析：使用 Filter 工具【漏斗标识】(如红框右一) 即可。

以此，您可以对其他区域的其他通道分别进行分析，是不是很赞呢！

这次分区的教程非常详细（看起来似乎有点复杂），其实你操作起来非常简单，点击十几下你就可以轻松完成一个图片的统计，至于数几百上千个细胞，让软件自己数去吧。结合往期基础教程一起巩固练习并使用吧。

希望大家用的愉快！