作者：周志杰/秦安 

来源：科研小助手

前言
最近研究发现骨作为内分泌器官至少分泌3种激素：成纤维细胞生长因子23（FGF23），载脂蛋白2（LCN2），和骨钙蛋白（OCN）。

成骨细胞是合成OCN的细胞，OCN是一种参与调节葡萄糖和能量代谢、以及其他功能的激素。在正常饮食情况下，Ocn缺陷小鼠（Ocn-/-）表现出糖耐量、胰岛素敏感性、血液循环中胰岛素水平的减低，以及能量消耗的降低与脂肪含量的增加。

机制研究通过细胞培养和小鼠实验表明OCN是通过促进胰腺β细胞分泌胰岛素、促进肌纤维的葡萄糖摄入、以及通过增加能量消耗实现对葡萄糖更好的调控。小鼠实验表明OCN在β细胞和肌纤维中的功能通过G蛋白偶联受体家族C组6成员A（GPRC6A）介导。这条通路似乎在人中得以保留，因为人的OCN可以结合并激活人GPRC6A，而人GPRC6A的突变或基因多态性与胰岛素抵抗相关。

OCN是一种小蛋白（在小鼠中有46个氨基酸，在人中有49个氨基酸），它由成骨细胞合成，被分泌之前它的3个谷氨酸残基（Glu）被γ-羧化。OCN的γ-羧化发生在内质网，由γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）所介导，该过程需要维生素K水平降低作为其必需的辅因子。

该转录后修饰增加了OCN对于羟基磷灰石的亲和力，后者是骨细胞外基质（ECM）的矿物成分。因此，由成骨细胞分泌的OCN绝大多数沉积于骨基质ECM中，构成了大量非胶原多肽。虽然γ-羧化的（Gla）和羧化不全的OCN（ucOCN）在血清中都可被探测到，大多数体内和体外研究表明在人和小鼠中OCN的内分泌功能是由ucOCN完成的。

最近研究证实，通过特异性地在成骨细胞中失活Ggcx，可以使得小鼠ucOCN的循环水平的增加和糖耐量的改善。另有研究表明，破骨细胞负责骨ECM中的OCN的部分脱羧和活化。总之，这些发现提示失活的γ-羧化的OCN由成骨细胞所合成并沉积于骨ECM中，在骨吸收过程中被破骨细胞活化并以ucOCN形式释放。

与很多其他肽类激素一样，Ocn cDNA的序列提示它首先被合成为一种由信号肽、前肽、和成熟激素组成组成的前激素原。这类前激素原的前肽如凝血酶原和辅因子IX都以被γ-谷氨酰羧化酶所识别的信号为特征，其前肽被γ-羧化。然而，前肽的γ-羧化和OCN分泌的重要性在体内未被研究过。

此外，OCN前肽的去除是否依赖γ-羧化过程尚未清楚。而OCN是一种在所有已知的γ-羧化蛋白中较为独特的蛋白，因为它可以在缺少前肽的情况下被有效地γ-羧化。最后，也是最重要的，谁是处理OCN前激素（pro-OCN）的内肽酶，以及OCN在骨内分泌功能中的重要性还不清楚。

因此，我们搜索了pro-OCN转换酶。基于此目的，我们聚焦于前蛋白转化酶（PCs）。PCs是一类丝氨酸蛋白酶，针对由碱性残基如精氨酸或赖氨酸组成的常见于前激素序列的特定模序。这些酶作用于分泌途径中或细胞外来裂解其他蛋白，使它们活化或失活，进而参与到很多生物过程的调控中。

前蛋白转化酶subtilisin/kexin包括前蛋白转化酶1（PC1），前蛋白转化酶2（PC2），弗林蛋白酶（furin），前蛋白转化酶4（PC4），前蛋白转化酶5A和5B（（PC5A和PC5B），成对碱性氨基酸裂解酶4（PACE4）及PC7，它们在调节多种肽激素例如胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素(ACTH)、胰高血糖素样肽1（GLP-1）和甲状旁腺素（PTH）的成熟和分泌过程中起关键作用。

在本文中，我们采用基于细胞学和遗传学的参数，发现furin作为内肽酶在成骨细胞中的pro-OCN处理过程中起作用。我们还发现了在细胞培养和体内试验中，成骨细胞中的OCN的γ-羧化和OCN的处理是2个独立的过程。在缺乏furin的小鼠成骨细胞中， pro-OCN的蛋白水解是活化该激素的关键。我们还发现furin还可能通过与OCN不相关的通路来调节能量代谢，从而影响食欲。

图1、PC在成骨细胞的RXRR模序处裂解pro-OCN

A、前体激素pro-OCN的前体蛋白示意图，包括Gla残基的大致位置和来自不同脊椎动物的OCN前肽序列的氨基酸序列：保守的RX（R/K）R模序被标成了黄色。一致性符号包含在下面的序列之中。单个星号代表完全保守的残基，冒号代表高度保守的残基，句号代表中度或微弱保守的残基。

B、WB分析来自转染了OCN-V5或R46A/R48A/R49A OCN突变（OCNAAA-V5）的原代成骨细胞的细胞上清液，均在C-末端用V5抗原决定基标记。

C、WB分析来自小鼠的分化的颅骨成骨细胞的、采用或不采用50μM Dec-RVKR-CMK（RVKR）处理后的细胞上清液中的内源OCN。

D、WB分析转染了OCN-V5的、采用或不采用50μM Dec-RVKR-CMK（RVKR）处理的CHO-IdID细胞的细胞的上清液和细胞提取物。

E、WB分析转染了OCN-V5或OCNAAA-V5的，采用或不采用50μM Dec-RVKR-CMK或20μM D6R处理的原代成骨细胞的上清液。

OCN前肽的C-末端模序由3个碱性氨基酸残基组成：Arg-Leu-Arg-Arg（RLRR49）（R，Arg，精氨酸；L，Leu，亮氨酸），该序列在脊椎动物中高度保守（图1A）。在多种分泌性蛋白中均发现了这种碱性残基模序是PCs的识别位点，因此我们假设pro-OCN可能在成骨细胞中被1种或多种PCs裂解。

当RLRR序列突变成ALAA时，原代培养的成骨细胞的培养基中分泌的OCN发生分子量变化，与OCN突变蛋白中的前肽保留时的分子量相一致（图1B），支持我们关于的RLRR序列是PCs裂解作用点的假设。

类似的，采用一种细胞渗透性的subtilisin/kexin样PCs抑制剂Dec-RVKR-CMK处理原代培养的成骨细胞，会导致原代培养的成骨细胞或被V5-标记的成骨细胞或CHO-ldlD细胞分泌的内源性OCN发生分子量的变化（图1C-E）。Dec-RVKR-CML处理的和ALAA突变诱导了相同的分子量变化，提示RLRR如果不是唯一被PC识别和裂解的序列，至少也是主要的被PC识别和裂解的序列（图1E）。

最后，用hexa-D-Darginine（D6R），一种非渗透性抑制剂（只能阻断细胞外而不能阻断细胞内的PCs）来处理成骨细胞，发现不会产生任何影响（图1E），说明裂解发生于细胞内。

上述数据表明，细胞内PC对成骨细胞的pro-OCN转变成OCN有贡献。

图2、Furin在体外裂解pro-OCN

A、小鼠中类kexin的PCs中未分化的和分化的成骨细胞的mRNA的相对表达水平。拷贝数从小鼠组DNA的标准曲线中计算而得，Actb作为内参。

B、体外处理GST-pro-OCN的分析，孵育0或15min，furin、PC5A、PC7和PACE4各组含有相同的酶单元数量。释放的OCN通过WB和OCN/GST-pro-OCN相对值来测量。

C、通过WB评估furin处理GST-pro-OCN的时间过程。

D、通过WB评估增加furin剂量对于体外处理GST-pro-OCN的影响，作用时间为60min。

E和F、WB分析作用时间为30min（E）或各种孵育时间（F）对体外furin之于GST-pro-OCN和R48A/R49A OCN突变（GST-RR/AA-pro-OCN）的影响。

G、WB分析furin蛋白在特定组织和细胞系中的表达。

为了确定成骨细胞中哪个PC负责pro-OCN的裂解，我们首先评估了8种subtilisin/kexin样PCs在该细胞中的表达。如图2A所示，编码furin（Furin）和PACE4（Pcsk6）的mRNAs在该细胞中高表达，而编码PC7（Pcsk7）和PC5A（Pcsk5a）的mRNA低表达。

Pcsk1，Pcsk2，Pcsk5b和Pcsk4的mRNA在成骨细胞中无法探测到或者表达处于极低水平。值得注意的是，Furin和Pcsk5a的表达在成骨细胞分化的时候被诱导。根据这些结果，我们随后测试了furin，PC5A，PC7和PACE4在体外裂解pro-OCN的能力。

在细菌中产生的重组GST-pro-OCN蛋白孵育于HEK293细胞的条件性介质中，被空载体或表达可溶性胞外酶域的furin，PC5A或PC7，或者被在昆虫细胞中表达并提纯的重组可溶性PACE4的载体所转染。

Furin，PC5A和PACE4，而不是PC7，被探测到裂解了GST-pro-OCN，释放成熟的OCN（图2B）。我们还注意到，当孵育的时间更短例如15min时，furin比PC5A和PACE4在裂解pro-OCN时更加有效（图2B）。

此外，进一步测试表明furin能够以剂量相关的方式在30分钟内裂解80%以上的pro-OCN（图2，C和D）。因为已知PC5A和PACE4主要作用于细胞外的或者结合在质膜上的底物，而furin主要在细胞内的分泌途径中起作用，这些结果，连同我们观察到的成骨细胞中的pro-OCN裂解被细胞渗透性的Dec-RVKE-CMV所抑制，而不被非细胞渗透性的D6R所抑制（图1E），提示pro-OCN主要是furin的底物。

重要的是，RLRR模序到RLAA的突变完全废除了furin在体外对于pro-OCN的裂解能力（图2，E和F），因此表明furin是在该双碱性基团位置上特异性裂解pro-OCN的。

与furin可能在成骨细胞中发挥重要作用的可能性相一致的是，furin被发现在成骨细胞中的表达水平比它在肝脏细胞、胸腺、MIN β细胞中的表达水平相当或更高，而目前已知这种酶没有其他多余的功能（图2G）。

上述数据表明，furin在体外特异性裂解pro-OCN。

图3、Furin而不是PC5是成骨细胞处理pro-OCN过程所必需的

A、在Cre介导的Furin失活的Furinfl/fl成骨细胞中，转染Ad-GFP（对照组成骨细胞）或Ad-Cre（Furin-/-成骨细胞）后采用PCR评估furin的mRNA表达水平。

B、WB分析从来自分化的Furinfl/fl的成骨细胞、被Ad-GFP或Ad-Cre转染后所分泌的OCN。

C、在Cre介导的Pcsk5失活的Pcsk5fl/fl成骨细胞中，转染Ad-GFP或Ad-Cre，采用PCR评估Pcsk5的mRNA表达水平。

D、WB分析从来自分化的Pcsk5fl/fl的成骨细胞、被Ad-GFP或Ad-Cre转染后所分泌的OCN。

E、WB分析在分化的Furinfl/fl颅骨成骨细胞、转染或不转染Ad-GFP或Ad-Cre、采用或不采用50μM Dec-RVKR-CMK或20μM D6R处理后所分泌的OCN。

我们因此评估了furin在成骨细胞pro-OCN成熟中的必需性。为此，我们将Furinfl/fl原代成骨细胞转染表达GFP的腺病毒（Ad-GFP），或转染表达Cre-GFP（Ad-Cre）的腺病毒来作为对照组与furin缺陷的成骨细胞作对比（Furin-/-成骨细胞）。

与对照组相比，Furin的表达在转染了Ad-Cre的成骨细胞中显著降低（图3A）。非常明显的是，原代成骨细胞中Furin的失活就足以诱导分泌的OCN的分子量改变（图3B）。相反的，编码PC5A和PC5B的Pcsk5的缺失，在原代成骨细胞中对于OCN的分子量没有明显影响（图3，C和D）。

此外，Dec-RVKR-CMK或D6R在Furin缺陷的成骨细胞中均不能对OCN的分子量产生明显影响（图3E），提示分泌的OCN仍保持在前肽状态。

上述数据通过Furin的表达缺陷研究提示Furin是成骨细胞处理pro-OCN过程所必需的。

图4、Furin和Pro-OCN在成骨细胞中的定位

A、典型免疫荧光图片显示原代成骨细胞转染FLAG-pro-OCN或来自p3xFLAG-Myc-CMV-23载体的R46A/R48A/R49A FLAG-pro-OCN突变（FLAG-pro-OCNAAA）。Furin是绿色的，FLAG（例如pro-OCN）是红色的，DNA是蓝色的。

B、转染或不转染FLAG-pro-OCN或FLAG-pro-OCNAAA的原代成骨细胞的红色信号区域的定量分析。

C、WB分析来自原代成骨细胞转染FLAG-pro-OCN或FLAG-pro-OCNAAA的细胞上清液和细胞提取物。

为了进一步观察furin和pro-OCN之间的相互作用，小鼠的成骨细胞被pro-OCN结构所转染，该前肽采用3X FLAG抗原决定基在N末端标记，细胞内pro-OCN和furin的定位采用免疫荧光评估。

如图4A所示，FLAG-pro-OCN和非裂解突变（FLAG-pro-OCNAAA）信号都与furin信号（中列图和底部图）有重叠，提示pro-OCN和furin的共定位。然而，FLAG-pro-OCNAAA在细胞内比FLAG-pro-OCN更丰（图4，中列图和底部图）。FLAG-pro-OCN免疫荧光信号强度定量分析和WB证实，当furin裂解位置突变时细胞内的pro-OCN水平会增高（图4，B和C）。

与之相一致的现象是，当采用furin缺陷的成骨细胞时（图3B），FLAG-pro-OCNAAA仍然分泌（图4C），提示前肽的滞留不会阻止该蛋白（OCN）的分泌。

总之，这些体外实验和细胞生物学试验支持furin是成骨细胞中负责处理pro-OCN的主要PC，如果不是唯一的PC的话。

图5、Pro-OCN处理和γ-羧化过程在成骨细胞中是相互独立的

A和B、WB分析来自于分化的小鼠成骨细胞的内源性总OCN和γ-羧化OCN（Gla OCN）的细胞上清液和细胞提取物，用或不用50 μM华法林（A）或50μM Dec-RVKR-CMK（B）处理。

C、WB分析来自转染OCN-V5或E13D/E17D/E20D OCN-V5突变（OCNDDD-V5）、用或不用50 μMDec-RVKR-CMK处理的成骨细胞上清液。

D、WB分析来自对照组小鼠（Ggcxfl/fl）血清中的和来自成骨细胞γ-羟化缺陷的小鼠（Cgcxosb-/-）的血清中的OCN免疫沉淀。总的OCN和r-羟化的OCN通过WB来评估。

E、LC-MS/MS分析来自小鼠分化的成骨细胞的、用或不用50 μM Dec-RVKR-CMK或50 μM华法林的细胞上清液。OCN前肽面积与总肽面积进行定量比较。

表1、LC-MS/MS分析小鼠分化的成骨细胞上清液、用或不用50 μM Dec-RVKR-CMK或50 μM华法林处理

在肝脏细胞中，γ-羧化这种已被广泛研究的蛋白转录后修饰主要发生在内质网（ER）。为了测试成骨细胞中pro-OCN处理和γ-羧化这2个过程是否相互关联，分化的成骨细胞采用华法林（华法林通过阻断维生素K的降低来抑制γ-羧化），或者Dec-RVKR-CMK处理，然后评估pro-OCN的裂解和γ-羧化。

如图5A所示，华法林有效地阻断了OCN的γ-羧化，但是不影响它的裂解。相反的，Dec-RVKR-CMK有效地阻断了OCN的裂解，但是对于它的γ-羧化没有影响（图5B）。类似的，将针对γ-羧化的3个OCN谷氨酸（E）残基的突变为天冬氨酸（D）（已知该突变可以阻止凝血酶原的转录后修饰），并不影响原代成骨细胞中的pro-OCN到OCN的成熟（图5C）。

我们还通过研究成骨细胞缺乏Ggcx的小鼠（Ggcxfl/fl OCN-Cre小鼠，Ggcxosb-/-小鼠）的体内试验评估了pro-OCN的γ-羧化对于它的裂解过程的影响。因为γ-羧化缺失阻止了OCN在这些小鼠骨ECM中的积聚，我们采用免疫沉淀和WB评估血清中OCN的处理过程。虽然在Ggcxosb-/-小鼠中，循环中OCN未被γ-羧化，它的移位和对照组血清中的OCN移位类似，提示OCN在体外被处理为成熟状态，即使在没有γ-羧化的情况下（图5D）。

最后，我们尽力来确定成骨细胞在正常条件下或furin依赖的裂解或γ-羧化被抑制的情况下的OCN更加精确的结构。出于这个目的，用vehicle，Dec-RVKR-CMV或华法林处理分化的成骨细胞后，其分泌的OCN采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法进行分析。收集分泌蛋白，离心，被Arg-C消化，后者可以把任何精氨酸残基裂解。

因此，如果pro-OCN在介质中存在的话，Arg-C可以释放缺少3个残基的OCN前肽，如KPSGPESDKAFMSKQEGNKVVNR。有意思的是，我们没有发现vehicle或法华林处理过的成骨细胞的上清液中有这种肽，而只是在用PC抑制剂处理过的成骨细胞的上清液中发现了它，同时伴有一些N末端的OCN前肽截断的碎片（表1和图5E）。

这些数据进一步提示pro-OCN裂解与OCN的γ-羧化无关，pro-OCN处理过程在成骨细胞中是充分有效的，因为在vehicle处理的成骨细胞中pro-OCN是完全消失的。最后，因为OCN前肽在正常条件下的成骨细胞上清液中是不能被探测到的，这提示了裂解的前肽（含降解的3个RRR）在细胞内被降解而不是被分泌。

这与早期报道的OCN前肽在人血清或人骨肉瘤上清液中不能通过放射免疫分析法所探测到是一致的。

以上数据表明，pro-OCN处理和γ-羧化过程在成骨细胞中是相互独立的。

图6、Furinosb-/-小鼠中pro-OCN的处理过程受损

A、提取于不同组织的组DNA，采用PCR来探测Furin的等位基因（△PCR）的敲除，Flox PCR用来做加载对照。WAT，白色脂肪组织；BAT，棕色脂肪组织。

B、WB分析Furinfl/fl或Furinosb-/-小鼠中骨髓来源的成骨细胞中的Furin的表达。

C、定量分析Furinfl/fl小鼠中的Furin蛋白的表达。

D、WB分析在9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠中总OCN和γ-羧化的OCN在骨提取物中的表达。

E、WB分析Furinfl/fl或Furinosb-/-小鼠血清中的OCN免疫沉淀。

F、9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠骨匀浆后，总的和γ-羧化的OCN的ELSA测定。

G、9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠血清中总的和ucOCN的ELSA测定。

我们的细胞培养数据显示，furin负责成骨细胞中的pro-OCN处理（即裂解），我们想知道在体内furin是否也是pro-OCN处理所必需的。为了解决这个问题，我们培育了成骨细胞中条件性敲除furin的小鼠（Furinfl/fl OCN-Cre小鼠，Furinosb-/-小鼠），因为所有细胞都缺乏furin的小鼠会在骨骼形成前就死在子宫中。

出于这个目的，Furinfl/fl小鼠与OCN-Cre转基因小鼠繁殖，可以产生Cre重组，在分化的成骨细胞中控制人OCN的启动子。

Furinosb-/-小鼠按照孟德尔比率所计算的出生，没有出现明显的发育异常。我们通过PCR进一步证实了furin位点重组只发生在骨骼组织中（图6A），Furinosb-/-小鼠相较于对照组成骨细胞培养来说，furin的mRNA和蛋白表达水平明显降低（图6，B和C）。

如图6D所示，Furin失活导致了pro-OCN的积聚和成熟OCN在骨中的缺失。

相应的，OCN在Furinosb-/-小鼠血清中只以前体形式出现（即pro-OCN）（图6E）。重要的是，通过成骨细胞培养的体外试验证实（WB及ELISA），furin缺乏并不影响骨ECM中pro-OCN的γ-羧化（图6，D和F）。

有意思的是，虽然总的骨OCN含量在Furinosb-/-小鼠中没有减少，ELISAs评估发现血液循环中的总ucOCN和ucOCN水平却降低了约一半，采用ELISAs评估OCN和pro-OCN（图6G）。我们因此假设在Furinosb-/-小鼠中，与成熟OCN相比，骨吸收过程中pro-OCN的脱羧和释放在有效度降低。

以上数据表明，Furinosb-/-小鼠中pro-OCN的处理过程受损。

图7、Pro-OCN不能被破骨细胞有效地脱羧

A和B、来源于Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠灭活颅骨的体外吸收分析，在有类成骨细胞的RAW246.7细胞存在的情况下，用或不用10ng/ml RANKL处理。（A）细胞培养上清液的总OCN和ucOCN的ELISA测定。（B）典型的颅骨TRAP染色图。

C、TRAP染色阳性的区域百分比。

D、WB分析在pH为7.5或4.3的37度PBS中孵育14天后的来自Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠骨提取物。

为了验证pro-OCN不能被破骨细胞有效地脱羧这个假设，我们采用取自对照组或Furinosb-/-小鼠的灭活的颅骨培养而得的RAW 264.7破骨前体细胞，用RANKL来诱导破骨细胞分化。当对照组骨的破骨细胞分化时，我们可以检测到总OCN和ucOCN的释放，而在Furinosb-/-小鼠的破骨细胞分化时，破骨细胞释放的总OCN减少，而ucOCN则探测不到（图7A）。

重要的是，在TRAP染色中，破骨细胞分化在Furinosb-/-小鼠中看起来与对照组相比较，似乎没有受到损害（图7，B和C），提示成骨细胞中的furin缺失不会对破骨细胞分化造成影响。

先前的研究发现在骨吸收过程中产生的酸性pH负责OCN的脱羧。因此，我们比较了成熟OCN和pro-OCN的脱羧，当其孵育在类似于破骨细胞的骨吸收陷窝环境的pH值条件下时（例如，pH4.3）。当对照组小鼠中的骨中OCN被提取出来后，可以在pH4.3的时候有效地被脱羧，而在Furinosb-/-小鼠骨中提取出来的pro-OCN却不能有效地脱羧（Figure 7D）。

总之，这些结果提示，在没有furin的情况下，成骨细胞分泌γ-羧化的pro-OCN，它类似于成熟的γ-羧化OCN，在骨ECM中沉积。然而，pro-OCN在骨吸收过程中的脱羧和释放很弱，导致了循环中的ucOCN水平减低。

图8、Furinosb-/-的小鼠的糖耐量减低

A、9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠空腹和餐后血糖水平。
B、9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠的GTT结果。小鼠禁食16h，随后注射2g/kg的葡萄糖。
C、9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠的空腹和餐后血清胰岛素水平。
D、9月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠的胰腺胰岛素含量。
E、4月龄的Furinfl/fl或Furinosb-/-的小鼠在高脂高糖饮食10周后的GTT结果。小鼠禁食6小时，然后注射1g/kg葡萄糖，在采用正常饲料饮食（A-D）或高脂高糖饮食（F）的雄性小鼠中进行代谢评估。

为了确定pro-OCN未裂解对于OCN内分泌功能的影响，我们随后研究了Furinosb-/-小鼠中的糖代谢。与同窝的对照组相比，9月龄的Furinosb-/-小鼠中出现餐后血糖水平显著增高（图8A）。

此外，9月龄的Furinosb-/-小鼠在予以糖负荷的时候，显示了糖耐量的减低（图8B）。

此外，与ucOCN通常支持β细胞的胰岛素分泌相一致的是，血清胰岛素水平在餐后状态的Furinosb-/-小鼠中显著降低，但是空腹血清胰岛素水平并不受影响（图8C）。

这些结果与Furinosb-/-小鼠中只在餐后血糖或在糖耐量实验中（GTT）血糖水平升高相一致（图8，A和B）。另外，与之前报道的相一致，ucOCN对于β细胞合成胰岛素有阳性作用，胰岛素含量在Furinosb-/-小鼠中的含量较正常小鼠也降低（图8D）。

最后，4月龄的Furinosb-/-小鼠进行高脂高糖喂养10周后，与年轻小鼠相比，其糖耐量降低（图8E）。

图9、Furinosb-/-的小鼠的能量消耗和食物摄入减少

A-E、6月龄的Furinfl/fl和Furinosb-/-的小鼠的代谢参数，（A）氧耗量，（B）二氧化碳释放量，（C）心脏产量（能量消耗），活动量的X轴（D）和活动量的y轴（E）。
F、12月龄的Furinfl/f-和Furinosb-/-的小鼠正常喂养后的附睾脂肪垫重量。
G-J、6月龄的Furinfl/fl，Furinosb-/-，OCN+/+，OCN-/-的小鼠的摄入量。（G和I）白天和黑夜的食物摄入量。（H和I）3天时间的食物总摄入量

因为OCN也增加了能量消耗，我们通过间接测热法评估了对照组和Furinosb-/-小鼠的能量平衡。在3月和6月龄时，饲料喂养的Furinosb-/-小鼠在暗期显示出氧耗量和二氧化碳生产量的增加。

例如，当小鼠更加活跃的时候（图9，A和B），这会导致整体能量消耗水平的显著减低（图9C）。我们观察到Furinosb-/-小鼠活动量在暗期和亮期没有减少（图9，D和E），提示在Furinosb-/-小鼠中能量消耗的减少不是因为这些动物活动量减少造成的。

12月龄的Furinosb-/-小鼠中能量消耗减少与附睾脂肪垫重量增加和全身脂肪组织百分比增加有关，虽然无论采用正常饲养还是高脂饲养，它们的体重与对照组小鼠相比都没有显著增加（图9F）。

总之（图8+图9A-F），Furinosb-/-小鼠的表型特征显示由成骨细胞表达的furin，在调节糖和能量代谢中起重要作用。我们的发现也支持pro-OCN这个激素的完全活化需要furin裂解处理之这个论断。

图10、配对喂养揭示Furinosb-/-小鼠有更加严重的代谢表型

4月龄的配对喂养的Furinfl/fl或Furinosb-/-小鼠的代谢表型。
A、配对喂养前、及喂养后2周和4周时Furinfl/fl或Furinosb-/-小鼠的体重。
B、配对喂养4周后总体脂肪之于体重的百分比。
C、配对喂养3周后的餐后血糖水平。
D、配对喂养4周后GTT结果。
E、配对喂养4周后的ITT结果。

3月龄和6月龄的Furinosb-/-小鼠在采用正常喂养时的糖耐量是正常的（见补充图，未列出）。此外，所有年龄的Furinosb-/-小鼠中采用胰岛素耐量试验（ITTs）评估胰岛素敏感性，其结果都是正常的（见补充图，未列出）。

这与Ocn失活导致了3月龄的正常喂养的小鼠中出现糖耐量和胰岛素抵抗相反。类似的，正常喂养情况下，Furinosb-/-小鼠和Ocn-/-小鼠相比，脂肪积聚更少（图9F）。因此， Furinosb-/-小鼠与Ocn-/-小鼠相比，其代谢表型是延迟的和更缓和的。

虽然有一些可能性可以解释这些差异，其中一个可能性是furin负性调节了能量代谢的其他方面，且与OCN无关。支持这个假设的现象包括，6月龄的Furinosb-/-小鼠中的暗期食物摄入量减少了约30%（图9G）。相应地，3天时间内总食物摄入量约减少了20%（图9H）。

相反的，相同年龄的Ocn-/-小鼠（6月）和相同遗传背景（例如，C57BL/6J）的小鼠与野生型小鼠相比，其食物摄入量都是正常的（图9，I和J）。总之，这些现象提示Furinosb-/-小鼠并没有像Ocn-/-小鼠一样出现强烈的胰岛素抵抗，可能部分因为其卡路里摄入的减少，这是一种之前研究认为可以改善小鼠中胰岛素敏感性的条件。

为了直接证实这种可能性，我们在评估糖耐量和胰岛素敏感性之前，成对饲养4月龄的对照组和Furinosb-/-小鼠2周到4周，以保证相同的卡路里摄入。如图10A，Furinosb-/-小鼠比成对培养的对照组小鼠更重，这与总体脂肪组织含量的比重增加相关（图10B）。

当配对喂养时，Furinosb-/-小鼠显示出高的餐后血糖水平和糖不耐受性表型（图10，C和D）。最后，在这些条件下，Furinosb-/-小鼠与对照组小鼠相比，通过ITT评估发现是胰岛素抵抗的（图10E）。

总之，这些结果支持：成骨细胞中furin的失活产生了2种不同的能量代谢调节效果：一方面，它降低了能量消耗，糖耐量，和胰岛素敏感性；另一方面，它降低了食欲。前一种效果可能是OCN依赖的，而后一种效果可能是与OCN不相关的。

本研究发现了furin作为PC负责成骨细胞中的pro-OCN转变成为成熟OCN。其结果显示，pro-OCN裂解为成熟OCN的处理过程可以调节血液循环中的有活性的ucONC水平，因为沉积在骨ECM中pro-OCN在骨吸收过程中难以被有效释放和脱羧。

相应的，furin基因失活的小鼠，其成骨细胞有类似于Ocn-/-小鼠报道的代谢异常，但仍存在一定的表型差异。这表明furin的调节能量代谢可能通过与OCN相关及与OCN不相关的2种方式。总之，我们的工作发现了以前未被描述过的骨内分泌的调节机制；和其他肽激素类似，它是与一种特异性的PC活性相关的。