2018CLSI 与2017CLSI的不同：更新mCIM和eCIM实验
公布了2018CLSI 新版的2018 CLSI M100规则** - 临床检验医学讨论版 -丁香园论坛 新版的2018 CLSI M100规则**
就来讲一讲两者的不同吧
先来讲 检测碳青霉烯酶的表型方法2018版的更新
一.两种实验的目的（mCIM和eCIM实验）
mCIM用于检测肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶，而eCIM是与mCIM联合使用以区分产金属酶和丝氨酸碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。mCIM可以单独进行实验，但eCIM必须同时和mCIM联合进行实验。仅当mCIM结果呈阳性时，eCIM结果才有效。
二．试剂盒材料
1. TSB肉汤（2ml）
2. 美罗培南纸片（10mg）
3. 1ml和10ml接种环
4. 营养肉汤（如MH、TSB）或生理盐水（3-5ml）
5. MHA平板（100mm或150mm）
6. 美罗培南敏感菌株-大肠埃希菌（ATCC 25922）
7. 0.5M EDTA（仅用于eCIM）
三．mCIM实验操作步骤
1. 取1ul接种环满环（肠杆菌科细菌）或10ul接种环满环（铜绿假单胞菌）的生长于血琼脂平板上的过夜培养纯菌落，于2ml TSB肉汤中；
2. 震荡混匀10-15秒
3. 每管放入一张含10ug美罗培南的无菌纸片，确认纸片浸没于菌悬液中
4. 35℃±2℃大气环境孵育4小时±15分钟
5. 孵育结束时，立即用营养肉汤或生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希ATCC 25922菌悬液（直接菌悬法）
6. 菌悬液制备和平板涂布必须15分钟内完成，干燥3-10分钟；
7. 用10ul接种环将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出，将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上。100mm的MHA平板最多贴4张纸片，150mm的MHA平板最多贴8张纸片。
8. 倒置平板，35℃±2℃大气环境孵育18-24小时
9. 量取抑菌圈直径
四．eCIM实验操作步骤
1. 取第二支含2ml TSB的肉汤管，管壁上标记细菌名称；加入20ul 0.5M EDTA溶液于2ml TSB中，EDTA最终浓度为5mM；
2. 剩下步骤同mCIM实验步骤1-9。mCIM和eCIM实验同步进行；
3. mCIM和eCIM实验管中的美罗培南纸片贴于同一块已涂布有大肠埃希菌ATCC 25922的MHA平板上。
五．结果解释之mCIM
1. 碳青霉烯酶阳性：美罗培南抑菌圈直径为6-15mm 或直径为16-18mm但抑菌圈内有散在菌落。若待测株产生碳青霉烯酶，纸片中的美罗培南被该酶降解，结果为无抑菌圈或抑制大肠埃希菌ATCC 25922的活性降低；
2. 碳青霉烯酶阴性：抑菌圈直径≥19mm。若待测菌株不产碳青霉烯酶，纸片中的美罗培南不被水解，仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长；
3. 碳青霉烯酶中性：抑菌圈直径为16-18mm，或直径为≥19mm但抑菌圈内有散在菌落。无法判断是否存在碳青霉烯酶；
图1. 10ul接种环取出美罗培南纸片（a）；将纸片贴于试管内壁并挤去多余水分（b）；同一接种环取出纸片（c）将纸片贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上；
图2a. 阴性对照肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706（A）和阳性对照肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705（B）
图2b. 碳青霉烯酶产生株。备注：mCIM结果阳性
六．结果解释之eCIM
1. 金属酶阳性：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≥5mm（如mCIM=6mm，eCIM=15mm，抑菌圈直径之差为9mm）。对于eCIM，忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。若待测株产生金属酶，与不含EDTA管相比，该酶活性将被EDTA抑制，纸片中的美罗培南未被细菌产生的金属酶充分水解，美罗培南仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长，进而出现抑菌圈；
2. 金属酶阴性：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≤4mm（如mCIM=6mm，eCIM=8mm，抑菌圈直径之差为2mm）。对于eCIM，忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。若待测株产生丝氨酸碳青霉烯酶，该酶活性将不受EDTA影响。含与不含EDTA管美罗培南的抑菌圈直径无差别或≤4mm。
图3a. mCIM和eCIM结果解释：
A: mCIM阴性（抑菌圈直径=20mm）；B：eCIM无效结果；
当mCIM结果为阴性时，不解释eCIM结果，因为碳青霉烯酶检测为阴性。
图3b. mCIM和eCIM结果解释: mCIM和eCIM阳性。
A：mCIM阳性 (抑菌圈直径为6mm）；B：eCIM阳性 (抑菌圈直径 = 15 mm，忽略抑菌圈内有针尖样散在菌落)。
报告：金属酶检测阳性
图3C. mCIM和eCIM结果解释: mCIM和eCIM阳性。
A：mCIM阳性 (抑菌圈直径为6mm）；B：eCIM阳性 (抑菌圈直径 = 19 mm，忽略抑菌圈内有针尖样散在菌落)。
报告：金属酶检测阳性
图3D. mCIM和eCIM结果解释: mCIM阳性但eCIM阴性。
A：mCIM阳性 (抑菌圈直径为6mm）；B：eCIM阴性 (抑菌圈直径 = 6 mm)。
报告：丝氨酸碳青霉烯酶检测阳性
七．报告：如下表所示。
仅mCIM
mCIM结果 eCIM结果 报告
阴性 无 碳青霉烯酶阴性
阳性 无 碳青霉烯酶阳性
中性 无 无法判断是否存在碳青霉烯酶，建议实验室讨论；
mCIM和eCIM联合实验
mCIM结果 eCIM结果 报告
阴性 不解释 碳青霉烯酶阴性
阳性 阴性 丝氨酸碳青霉烯酶
阳性 阳性 金属酶
中性 不解释 无法判断是否存在碳青霉烯酶，建议实验室讨论；
八．注释
1. 中性结果：（1）检查待测菌株和大肠埃希菌ATCC 25922的纯度；（2）检查美罗培南的质控结果；（3）重复mCIM和/或eCIM实验；
2. 仅mCIM实验：某些菌株可能出现美罗培南抑菌圈内出现散在菌落，若抑菌圈直径为6-18mm，结果判定为碳青霉烯酶阳性；若抑菌圈直径≥19mm，结果判定为中性结果；
3. 仅eCIM：忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。解释结果严格按mCIM和eCIM实验的抑菌圈直径差异进行判断；
4. mCIM阴性但eCIM阳性的结果不应出现。如果出现此种结果，应对质控各环节进行检查，若重复测试结果仍如此，认为实验结果无效；
5. CLSI当前仅对mCIM实验中1 ul满环的肠杆菌科细菌和10 ul满环的铜绿假单胞菌接种菌量进行标准化；
九．质量控制：如下表所示。
质控菌株 细菌特征 预期结果
肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705 KPC阳性，丝氨酸碳青霉烯酶产生株 mCIM阳性，eCIM阴性
肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706 碳青霉烯酶阴性株 mCIM阴性
肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146 NDM阳性，金属酶产生株 mCIM阳性，eCIM阳性
