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遗传发育

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论坛首页  >  遗传学与发育生物学讨论版
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【公告】实验胚胎方面的内容(组帖)，请讨论！！！ [精华]

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楼主 schorr
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这个帖子发布于15年零203天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
nobelli、shengyongwang战友所在实验室目前在哺乳动物体外受精、胚胎分割、核移植、胚胎移植研究方面做了许多大胆的尝试，并取得了一系列成果。建立了简便快速、高效的半胚冷冻和冻胚分割程序；获得不同日龄的同卵双生山羊羔和山羊冻胚分割的同卵双生后代，其成功率达到国际领先水平；建立起一整套山羊卵核移植的程序，获得世界首批山羊卵核移植、体细胞核移植后代。
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2005-07-07 14:28 浏览 : 3952 回复 : 29
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schorr 编辑于 2005-07-15 07:57
  • • 年轻女性，腹痛伴血肌酐升高
楼主 schorr
schorr

丁香园荣誉版主

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  • 2楼
哺乳动物细胞核移植教案、程序
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1596206_0.html
转基因动物及基因敲除讨论区
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=296949&sty=1&tpg=1&age=0
实验动物模型专区
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=1013998&sty=1&tpg=1&age=0
2005-07-07 14:39
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schorr 编辑于 2005-07-23 15:24
  • • 【规培笔记128】—工作报告偶遇，颅脑MR，您能看出几处异常？据说工作中很罕见！
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  • 3楼
在胚胎体外生产中卵母细胞体外成熟是非常关键一个环节和步骤，因为在早期胚胎发育母源型向合子型转换之前所需要大量的蛋白质和mRNA均是源于卵母细胞成熟过程中所积累的。因此就可能影响卵母细胞成熟一些因素提一些自己的看法，希望对于做胚胎工作的朋友有所帮助：
1：IVC多是从屠宰厂采集的卵巢保存的温度很重要，一般用无菌的生理盐水，保存温度在25－35度之间，我曾经做过在14度牛卵母细胞IVC，发现成熟率也很高可达70％。从我个人观点来说，温度高反而不利于卵母细胞成熟，最好控制在28度左右。
2 采集的卵巢要尽快回实验室采集卵母细胞，采集卵母细胞时，注意的一点就是温度，采出的卵母细胞最好放在恒温板上，拣卵的体视显微镜也最好有恒温板，如果没有速度要快。总之一句温度恒温接近体温，操作快，尽快放入培养箱。
3 培养基：这其中最主要的一个是血清，另外一个是激素，这其中激素是最为关键的。血清、激素最好用进口的，国产的激素效价不稳定。我个人认为如果你所作的实验成熟有问题，最先考虑的就是这两方面，如果这两个因素排除再去考虑其他方面。
当然影响卵母细胞成熟的最主要的因素还是卵母细胞本身的质量。其他因素还很多，如水、气、试剂、CO2等的纯度，卵母细胞的采集方法等。我只是就一些共性谈了一点自己的看法，希望各位朋友有什么问题集大家之智慧来共同解决。
2005-07-09 00:37
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应schorr之邀发第二贴
胚胎体外操作一般要经过胚胎培养这一过程。和体内胚比较，体外生产的胚胎染色体倍型的异常率高出很多，rRNA基因的活性明显不同。体外培养系统的缺陷也是导致胚胎吸收、死亡、流产、死胎以及胎儿过大综合症的一个重要方面。我认为主要的原因是体内胚发育是生长在一个动态环境中，为早期胚胎发育基因的时空性表达提供了必要的物质基础，比如因子、蛋白和激素等，是这些物质启动了或者是激活了基因的表达。目前这方面的研究还很困难，存在很多空白，要想体外能达到与体内胚胎一样的效果，目前来说很难。
目前所用的培养体系作个介绍
1 常用的培养液
小鼠多用CZB、KSOM，猪胚胎多用NCSU23，牛、绵羊、山羊胚胎较多用SOF和CR1。在这些培养液中，共同的特点是不含葡萄糖，以乳酸和/或丙酮酸为能量供应物。小鼠、仓鼠、绵羊、牛及人的早期胚胎在致密化之前，对葡萄糖的利用能力很有限，而主要以丙酮酸、乳酸和氨基酸为能量代谢的底物。至致密化期以后，胚胎对葡萄糖的摄入和利用都增加。在不含氨基酸的条件培养液中,葡萄糖甚至会抑制胚胎的早期卵裂。葡萄糖对早期胚胎发育的抑制作用与它在磷酸盐存在的情况下可以诱导细胞呼吸的抑制有关，呼吸的抑制会导致ATP产生效率的下降，从而抑制乳酸/氨基酸介导的发育程序。早期胚胎虽然不以葡萄糖为能量底物,但葡萄糖或其通过磷酸戊糖途径代谢的残基参与一些物质如三酰甘油酯、磷脂、核酸、NADPH等的生物合成。自然情况下葡萄糖也存在于动物输卵管和子宫液中，所以体外培养液中低剂量的葡萄糖的添加是必要的。一般都是在胚胎发育阻滞过后添加。牛、羊阻滞期是8－16细胞，小鼠是2－细胞。
2．培养液中几种成分
（1）：血清：血清是胚胎培养中添加的主要蛋白质源物质，它在保持细胞的存活、促进生长、维持细胞pH及渗透压的稳定、增加细胞弹性及膜的完整性等方面都发挥着重要作用，但血清组成复杂，包括生长因子、激素、维生素、矿物质、细胞因子以及其他一些还未确定的物质。血清成分的多样性决定了它对胚胎的影响也是复杂多元的。血清的存在对胚胎的最初发育有损害作用，而对后期胚胎的发育有利，因此在许多研究中血清是在胚胎培养48～72h后加入。
牛血清白蛋白(BSA)是培养液中常用的一种蛋白源物质，能结合培养液中的一些胚胎毒性物质，对胚胎有保护作用，它也能增加胚胎中的细胞数量。单独使用BSA并不能完全取代血清的作用，说明血清中其他一些有用因子不包括在BSA中。血清存在的情况下，BSA的加入能促进胚胎的发育。但是一定注意的是：一定要用无脂肪酸的BSA一般在0.3－0.8％
（2）生长因子与细胞因子：目前比较确定的是IGF-I、IGF-II及EGF及其受体基因在早期胚胎中表达，说明自然情况下，IGF、Insulin在胚胎发育中有作用。体外培养液中加入IGF-I或Insulin能阻止细胞凋亡，促进细胞的增殖，对胚胎的发育有利。EGF是血清和卵泡液中都存在的生长因子，无血清培养液中加入EGF能促进牛胚胎的发育，增加蛋白质的合成和囊胚的孵化。
（3）其他成分：体外培养液中加入氨基酸有利于克服胚胎的发育阻滞，不仅能促进胚胎的早期发育，而且增强其植入后的发育能力。胚胎致密化之前，必须氨基酸没有作用，甚至对胚胎发育产生副作用。但必需氨基酸对后期胚胎的发育有促进作用，主要表现在增加内细胞团细胞分裂率和植入后胎儿的发育能力。非必需氨基酸和谷氨酰胺对致密化后期胚胎的发育也有利，能促进胚胎向囊胚的发育和胚泡的形成，并增加滋养层细胞的数量和囊胚的孵化能力。
注：在添加成分中，如果用sigma的一定要看是经过细胞检测过得，这样的获号才可以应用到胚胎上。在配置培养液时pH也是应该注意的。
3其它培养方法
发育阻滞是胚胎体外培养中的一个主要困难，体细胞共培养或条件培养液能更好的支持胚胎发育，在通常使用的20%O2培养环境下,体细胞会下调O2紧张度到对胚胎毒性更小的水平。增加胚胎培养的密度可以增加胚胎的发育能力,胚胎分泌的一些促生长因子在其中起作用。多采用输卵管上皮细胞、颗粒细胞或卵丘细胞以及其它生殖道细胞或非生殖道细胞都有。
现在针对无透明带卵核移植胚培养要求必须进行单个培养
(1) 微滴培养 用胚胎培养液在培养皿上做好5－20微升的微滴，但是胚胎培养液中蛋白质的浓度要高（如2020mg/ml BSA或20％ FCS）防止胚胎粘连。
(2) 微穴法培养系统 在四孔板的一个孔中用加热的铁针来回运动并且适当用力做好一些小孔，并且在使用之前消毒，在使用时在四孔板中加培养液400－600微升，覆盖石蜡油。最后，在每个小孔中放入一个重构胚。
(3) 明胶－孔系统 用胚胎培养液溶解1%明胶无BSA和氨基酸，然后在四孔板中铺上一层明胶，接着在孔中放入胚胎培养液400－600微升，上覆盖石蜡油。用直径50－100μm的塑料小管在明胶上做好一排排的小孔。最后，在每个小孔中放入一个胚胎。
2005-07-12 22:04
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