【背景】第一次养神经干，讨到了三管冻存的P2代神经球，试着自己培养。第一管……恩算是练手了，本直播从第二管开始！            立贴求保佑神经干成球增殖保佑保佑！

【立贴目的】分享交流培养经验（作为一名小白，更多希望能向有经验的前辈们请教，改进自己的protocol。也希望自己的失败经验能帮到后人。本贴争取每日更新~~~~欢迎批评、指教、咨询、分享。但是请勿把本帖作为Protocol！！

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【细胞信息】大鼠14.5天胎鼠的大脑组织

【培养基配方】——维持干性

Gibco     21103049    neurbasal培养基    

Gibco    12587010    B27 minus   VitA                2%

Gibco    35050061   Glutamax                             1%

Peprotech   400-29    Recombinant Rat FGF-basic     10-20 ng/ml

Peprotech   400-25    Recombinant Rat EGF-basic     10-20 ng/ml

Gibco    15140-122    青霉素链霉素                       1%

（可选）Heparin    5ug/ml（这个我第一次加过一次，感觉没啥效果，据说是为了延长因子的寿命，反正请教过很多人，也有不少说不加的，所以我就没加）

【培养容器】

NEST untreated 6孔板

这个吧，因为之前用TC处理的瓶子、皿、板都发生了贴壁的问题，所以费尽功夫找到了untreated的培养容器，效果怎么样还不知道，过几天应该就能有结果。

【培养方式】

悬浮培养…………不能贴壁，贴壁了就不增殖了。。。

——————————————以上为基本信息，下一贴说第一天的故事（今天）——————————————

2017.7.16 实验第二天

1、按照经验，复苏后第一天换液（全量换）

2、保险起见先37℃温浴培养基

3、换液吸取细胞的时候，发现有一些神经球（大的肉眼可见）没吸起来，镜下看球掉在底面上变成饼（准备先发一篇《神经饼的培养》^_^）了，所以以后换液不全吸走，留一点。。。。。。。（重悬后还是神经饼，希望明天能恢复，至少变成神经铜锣烧）

4、200g 3min离心能够保证上清无神经球（原来的protocol是100g 5min，经观察离不干净），有文献报道250g 2min，所以认为这个修改没问题

5、考虑到悬浮细胞换液损伤比较大，所以准备隔天换液（间隔的那天加1ml培养基补充细胞因子）

6、感觉10ng/ml和20ng/ml没啥区别。。。。。

7、继观…………