未知序列是指非测序物种的序列，还是指除此之外，做Blast也没有结果呢？不知道能不能告知是什么物种呢？

出现非预期的序列，污染的可能很大，污染包括样本污染和测序过程污染。建议你这边核查一下取样和送样过程中有没有污染，如果确认没有，问题可能是在公司那边，问一下是不是建库有问题(放心，没有确实的证据，公司那边肯定不会承认的)。

也可能是测序过程有污染，二代测序仪都是好多个文库混在一起测，数据出来之后按adapter序列拆，如果这时有个人的序列和你是相同的adapter序列，那他的数据就是你的了......

给楼主几个处理方案吧

1.向公司问清楚有没有上述情况发生，如果有，谁出的问题谁解决，如果没有，下一步。

2.1 穷方法：把数据map到参考基因组，再把map到的reads转成fastq文件。这种方法是逼到绝境的时候再用，因为可能有少量其它物种的reads也能map到，更致命的是，有部分序列是没有map到但确实是你需要的reads，这些reads有时是关键信息。

2.2 有钱法：重新取样，小心送样，跟公司说你再给我测一次。如果你确认样品没有问题而且出现的相同的结果，那么按照这个数据分析吧，你可能发现了新大陆！如果结果明显和第一次测序结果不同，那么准备好撕逼吧。

3. 麻烦告诉一下公司名字，我要记在小本本上。

ps：拿未知的序列去做blast可能会对提供污染的证据有所帮助。

修正一下，上面的内容感觉有一些偏激，具体怎么做得根据实验背景决定。

如果没有经验的话，一定要和他们公司的技术支持多做沟通，听一下他们的建议。你想问的两点，在公司那边都可以得到详细的解答。

做RNAseq，如果分析内容涉及到表达量的分析，几年前的样本确实是有点太久了，公司在了解你的样本信息和分析要求之后，应该是有义务提醒你可能存在的风险的。我想你需要了解一下他们有没有以前的项目中出现过大量未知序列，有没有过处理长期保存的样本的经验，以及最后的效果如何等等。总之，多做沟通，一直到消除你的疑虑，毕竟你出了钱。

我的专业范畴不在人类转录组，抱歉给不了更多建议。