刚才忘记上传Snapgene的软件了，这里附件可以下载

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                            CRISPR-Cas9细胞水平实验基本操作流程

1)设计sgRNA ：确定目标基因序列后，利用sgRNAcas9 程序筛选高特异性靶向sgRNA，并设计含有合适酶切位点的引物，送公司合成。

      图1. sgRNAcas9程序（www.biootools.com）

sgRNAcas9简介-包含有sgRNA筛选和脱靶效应评估新算法，该软件包具有以下功能：

（1）能协助快速设计和筛选活性高，特异性强的sgRNA；

（2）能批量设计引物用于构建sgRNA表达载体；

（3）能批量提取靶位点或预测的潜在脱靶位点侧翼序列用于引物设计，方便进行实验验证；

（4）能协助快速构建sgRNA表达文库和大规模构建基因修饰动物模型。

2）构建sgRNA表达载体：将两条引物按照如下体系，退火后连接进sgRNA表达载体中，转化DH5a细菌，挑取单克隆测序鉴定。

Annealing and cloning procedure:

1. Anneal each pair of oligos:

1 µl oligo 1 (100 μM)

1 µl oligo 2 (100 μM)

8 µl H2O

10 µl total

Anneal in a thermocycler at 95℃ 5 min and then leave on the bench at RT to cool down for 1hr. Dilute the annealed oligo 1:250 (250 - fold).

2. Set up digestion reaction: （pX330/pX335载体和内切酶BbsI为演示案例）

X µl pX330/pX335 or other backbone vector (at least 2 µg)

2 µl 10X NEBuffer 2.1

1 µl BbsI (NEB) Use more if cutting more DNA

H2O to final Volume of 20 µl

Incubate the digestion reaction at 37oC for at least 4hr. Run ~200ng on agarose gel to ensure COMPLETE digestion. When digest is complete, heat inactivate (65°C for 20 min) or column purify linearized plasmid. 

3. Set up ligation reaction:

X µl pX330/pX335 BbsI digested vector (100ng)

2 µl annealed oligo duplex from step 1 (1:250 dilution)

2 µl 10x DNA ligase buffer (make sure fresh, else ATP or DTT may be shot)

1 µl T4 ligase

Y µl H2O to 20 µl final volume

- Incubate the ligation reaction according to manufacturer recommendations.

4. Transformation with 1 - 2 ul of the final product into competent cells.

5. Pick colony and sequence verify with U6 sequencing primer (U6seqF: ACTATCATATGCTTACCGTAAC)

3）制备质粒：用去内毒素试剂盒抽提质粒，测定浓度，琼脂糖电泳检测质粒质量。

sgRNA表达质粒

Cas9表达质粒

4）培养细胞和转染

a）准备培养皿，培养细胞。

b）按照Lipofectamine® 2000转染说明书转染细胞，质粒质量比1:1

野生型：无任何处理

对照组：U6-sgR-empty

        Cas9

实验组：U6-sgR-gene

        Cas9

c）转染48h或72h后提取细胞基因组DNA，提前设计好检测on-target或预测的off-target引物，PCR扩增目的片段 (sgRNAcas9程序包可批量提取基因组侧翼序列)。注: off-target sites来自sgRNAcas9 软件预测（OT, POT）

5）T7E1酶切法检测突变体

T7 核酸内切酶 I 是一种具有底物结构选择性的酶。该酶以不同的活性作用于不同的 DNA底物。切割特定底物时，必须控制酶量和反应时间。反应温度超过42℃时，会增加非特异性核酸酶活性。避免反应温度超过55℃，会导致酶活性降低。

a) PCR扩增出带有突变位点(CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，长度约500bp，突变位点最好不位于PCR片段中央，这样将切割出两条大小不同的带。

b)突变体DNA与野生型DNA的PCR产物按如下体系进行混合，进行加热变性、退火复性处理。

      表1. T7E1酶切体系和反应条件

c)上述反应体系分别加入0.5ul T7E1酶，37℃反应30 min后，跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

图2. T7E1酶切法检测图

6）测序评估：将PCR产物连接进T载体中，转化进DH5a细菌，随机挑取15-20个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。

图3. 单克隆测序

7）PAGE胶检测突变体：制备非变性PAGE胶，检测PCR产物，检测on-target 或预测的off-target sites位点 (可选方法)。

图4. PAGE胶检测突变体模式图（REF. SCIENTIFIC REPORTS,2014）

8）设计ssODN寡核苷酸（KI）(可选方法)。

Designing an ssODN template for HR-mediated repair

5’ — (~60 - nt 5’ homology) NNN NGG (~60 - nt 3' homology) — 3’