• 论坛首页
  • 我的丁香客
  • 找人
    查找好友
  • 更多
    丁香园
    丁香通
    丁香人才
    丁香会议
    丁香搜索
    丁香医生
    丁香无线
    丁香导航
    丁当铺
    文献求助
    医药数据库
    丁香诊所
    来问医生
登录 注册

核酸技术

关注今日:17 | 主题:347220
论坛首页  >  核酸基因技术讨论版   >  CRISPR/Cas
  • 发帖
    每发1个新帖
    可以获得0.5个丁当奖励
  • 回帖

分享到:

  • 微信

    微信扫一扫

  • 微博
  • 丁香客
  • 复制网址

CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建

  • 只看楼主
  • 页码直达:
  • 直达末页
楼主 帆帆0816
帆帆0816
科室保密
铁杆站友

  • 12
    积分
  • 937
    得票
  • 507
    丁当
  • 1楼
这个帖子发布于4年零6天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

1、质粒骨架的选择

CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种,Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C. elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus,根据质粒所携带的编辑基因的不同,可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2(可剪切RNA)。当然,还有一些筛选标记,如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等,我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种,最具有争议的Ngago,本楼主也重复过这个试验,也和大多数重复的人一样,GFP验证试验时,看到荧光显著减弱(本人还特意构建了一种Ngago载体,效果比韩老师的效果好很多),但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低,非常遗憾自己想法太简单,以先入为主认为是切割而没有去验证;最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型(斑马鱼的眼睛上有缺陷),这个就是很强的提示,需要去做下一步,尽管基因组上没有被切割,有表型,那势必会去看该基因表达的数据,最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好,knock down 有表型,如果没表型,估计也会放弃。这里就说到这,有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有,网址http://www.addgene.org/crispr/。


2、酶切位点的选择

插入sgRNA的酶切位点,质粒基本为这两种,BsmbI和Bbsi,具体可以参见该质粒的protocol,后续的连接、转化、验证protocol里面有,我就不啰嗦了。哦还忘了一件事,使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱,非常方便,强烈推荐!!



以慢病毒载体V2为例具体说明


3、同源臂的设计

同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段,长度大约1kb-2kb,效率还可以。当然了,有人也用40-100bp做了也做成功了,但基本原则是越长效率越高。1kb-2kb效率已经很高,所以这个最合适。有相关文献支持,自己Pubmed查看。


4、启动子、目的基因及其终止子的扩增

这里也没什么可说的,启动子在我们选择质粒的时候就决定了,当然我们还可以改造以提高sgRNA的表达效率,这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子,替换上去就ok了。

目的基因的话,如果我们要做敲除,基本就是根据基因组,在外显子区域设计sgRNA序列,切割后以非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ),造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式,同源性重组(Homologous recombination,HR)同源性重组修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性,若其中一条染色体上的DNA发生双股断裂,则另一条染色体上对应的DNA序列即可当作修复的模版来回复断裂前的序列,因此在某些条件下,同源性重组又称作基因转换(gene conversion)。该方法是用于敲入基因,这个同时,我们可以加入抑制NHEJ修复的酶,同时就会促进HR修复,提高重组插入效率。

终止子的话,没什么特别,基本可以通用,SV40终止子、BGH终止子等。

5、donor载体的连接及克隆测序

donor载体的连接及克隆测序这个就是我们分子生物学学生的基本功了,就不叙述了。

6、细胞转染及载体功能的验证

细胞转染的话,参见说明书就好了,转染试剂有lipo2000(适合siRNA和DNA共转染)、lipo3000(适合DNA)、以及罗氏、qiagen的等。当然还有国产的一些转染试剂,实验室穷点就可以买下,效果还可以,汉恒生物的,比较便宜。



还有什么问题,可以留言,最近要考博士,所以不能及时回复望谅解


  • 邀请讨论
  • 不知道邀请谁?试试他们

    换一换
2017-01-11 09:51 浏览 : 67310 回复 : 43
  • 投票 65
  • 收藏 610
  • 打赏
  • 引用
  • 分享
    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 继续读博还是回家工作
楼主 帆帆0816
帆帆0816
科室保密
铁杆站友

  • 12
    积分
  • 937
    得票
  • 507
    丁当
    热
  • 2楼

刚才忘记上传Snapgene的软件了,这里附件可以下载



  • snapgene_viewer_3.3.0_win.rar(31386.55k)
2017-01-11 09:54
  • 投票 3
  • 收藏 9
  • 打赏
  • 引用
  • 分享
    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 死亡患者危重讨论怎么写?
楼主 帆帆0816
帆帆0816
科室保密
铁杆站友

  • 12
    积分
  • 937
    得票
  • 507
    丁当
  • 3楼

这里是关于植物基因编辑的文章




  • 植物cas9 质粒构建.pdf(6768.44k)

  • cas9 编辑拟南芥 烟草 玉米水稻.pdf(17932.0k)
2017-01-11 09:58
  • 投票
  • 收藏 4
  • 打赏
  • 引用
  • 分享
    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 2020年广东高级评审结果已出!
楼主 帆帆0816
帆帆0816
科室保密
铁杆站友

  • 12
    积分
  • 937
    得票
  • 507
    丁当
    热
  • 4楼

                            CRISPR-Cas9细胞水平实验基本操作流程

 

 

1)设计sgRNA :确定目标基因序列后,利用sgRNAcas9 程序筛选高特异性靶向sgRNA,并设计含有合适酶切位点的引物,送公司合成。


      图1. sgRNAcas9程序(www.biootools.com)

sgRNAcas9简介-包含有sgRNA筛选和脱靶效应评估新算法,该软件包具有以下功能:

(1)能协助快速设计和筛选活性高,特异性强的sgRNA;

(2)能批量设计引物用于构建sgRNA表达载体;

(3)能批量提取靶位点或预测的潜在脱靶位点侧翼序列用于引物设计,方便进行实验验证;

(4)能协助快速构建sgRNA表达文库和大规模构建基因修饰动物模型。

 

2)构建sgRNA表达载体:将两条引物按照如下体系,退火后连接进sgRNA表达载体中,转化DH5a细菌,挑取单克隆测序鉴定。

Annealing and cloning procedure:

1. Anneal each pair of oligos:

 

1 µl oligo 1 (100 μM)

1 µl oligo 2 (100 μM)

8 µl H2O

10 µl total

Anneal in a thermocycler at 95℃ 5 min and then leave on the bench at RT to cool down for 1hr. Dilute the annealed oligo 1:250 (250 - fold).

 

2. Set up digestion reaction: (pX330/pX335载体和内切酶BbsI为演示案例)

 

X µl pX330/pX335 or other backbone vector (at least 2 µg)

2 µl 10X NEBuffer 2.1

1 µl BbsI (NEB) Use more if cutting more DNA

H2O to final Volume of 20 µl

 

Incubate the digestion reaction at 37oC for at least 4hr. Run ~200ng on agarose gel to ensure COMPLETE digestion. When digest is complete, heat inactivate (65°C for 20 min) or column purify linearized plasmid. 

 

3. Set up ligation reaction:

 

X µl pX330/pX335 BbsI digested vector (100ng)

2 µl annealed oligo duplex from step 1 (1:250 dilution)

2 µl 10x DNA ligase buffer (make sure fresh, else ATP or DTT may be shot)

1 µl T4 ligase

Y µl H2O to 20 µl final volume

 

- Incubate the ligation reaction according to manufacturer recommendations.

 

4. Transformation with 1 - 2 ul of the final product into competent cells.

 

5. Pick colony and sequence verify with U6 sequencing primer (U6seqF: ACTATCATATGCTTACCGTAAC)

 

3)制备质粒:用去内毒素试剂盒抽提质粒,测定浓度,琼脂糖电泳检测质粒质量。

sgRNA表达质粒

Cas9表达质粒

 

4)培养细胞和转染

a)准备培养皿,培养细胞。

b)按照Lipofectamine® 2000转染说明书转染细胞,质粒质量比1:1

 

野生型:无任何处理

对照组:U6-sgR-empty

        Cas9

实验组:U6-sgR-gene

        Cas9

 

c)转染48h或72h后提取细胞基因组DNA,提前设计好检测on-target或预测的off-target引物,PCR扩增目的片段 (sgRNAcas9程序包可批量提取基因组侧翼序列)。注: off-target sites来自sgRNAcas9 软件预测(OT, POT)

 

 

 

 

 

 

 

 

5)T7E1酶切法检测突变体

T7 核酸内切酶 I 是一种具有底物结构选择性的酶。该酶以不同的活性作用于不同的 DNA底物。切割特定底物时,必须控制酶量和反应时间。反应温度超过42℃时,会增加非特异性核酸酶活性。避免反应温度超过55℃,会导致酶活性降低。

 

a) PCR扩增出带有突变位点(CRISPR/Cas9的target site)DNA片段,长度约500bp,突变位点最好不位于PCR片段中央,这样将切割出两条大小不同的带。

 

b)突变体DNA与野生型DNA的PCR产物按如下体系进行混合,进行加热变性、退火复性处理。

 

      表1. T7E1酶切体系和反应条件


 

c)上述反应体系分别加入0.5ul T7E1酶,37℃反应30 min后,跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

 


图2. T7E1酶切法检测图

 

6)测序评估:将PCR产物连接进T载体中,转化进DH5a细菌,随机挑取15-20个单菌落进行测序,评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。

 


图3. 单克隆测序

 

 

 

 

7)PAGE胶检测突变体:制备非变性PAGE胶,检测PCR产物,检测on-target 或预测的off-target sites位点 (可选方法)。


图4. PAGE胶检测突变体模式图(REF. SCIENTIFIC REPORTS,2014)

    

 

8)设计ssODN寡核苷酸(KI)(可选方法)。

Designing an ssODN template for HR-mediated repair

5’ — (~60 - nt 5’ homology) NNN NGG (~60 - nt 3' homology) — 3’

 

 



2017-01-11 10:04
  • 投票 4
  • 收藏 19
  • 打赏
  • 引用
  • 分享
    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 普放病例分享31:X线虽有不足但有用,请各位上眼

关闭提示

需要2个丁当

丁香园旗下网站

  • 丁香园
  • 用药助手
  • 丁香通
  • 文献求助
  • 丁香人才
  • 丁香医生
  • 丁香导航
  • 丁香会议
  • 手机丁香园
  • 医药数据库

关于丁香园

  • 关于我们
  • 丁香园标志
  • 友情链接
  • 联系我们
  • 加盟丁香园
  • 版权声明
  • 资格证书

官方链接

  • 丁香志
  • 丁香园新浪微博
引用回复