十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。
 

CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
 

将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
 

“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
 

不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRNA 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNAs 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。
 

近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
 

如何 CRISPR 我的靶标？

由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。

gRNA 的长度约为 80 个核苷酸，包含两个区域： gRNA 5' 端前 20 个核苷酸对应于靶标 DNA，能结合在靶标 DNA 上，剩余的约 60 个核苷酸（gRNA 长度取决于表达 gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助 gRNA 与 Cas9 结合，并由此指导与 DNA 的结合。
 

gRNA 与 Cas9 一样，也是通过质粒表达的，从 Addgene 可以购买几种这种质粒（65 美元），但是与 Cas9 不同的是，我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码 20 个碱基，与靶标 DNA 结合的片段，将其克隆进表达质粒里（编码 gRNA 其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了）。唯一的设计要求就是，gRNA 上要有一个片段，能与由任意核苷酸序列（N）+5' 末端两个胞嘧啶核苷酸（-NCC）的 DNA 结合。这是因为 gRNAs 似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基（-NGG）的 DNA 片段结合最好，这种-NGG序列也就是 PAM 结构（protospacer adjacent motif）。
 

要在靶标 DNA 区域中挑选合适的 20 个碱基对，有几个方案可以选择，比如麻省理工学院的 CRISPR Design（crispr.mit.edu）；德国癌症研究中心开发的E-Crisp （www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）；还有 ZiFiTtargeter（zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu）。另外也可以筛选整个基因组，找到与你的靶标位点相似的其它位点。
 

其中只有 CRISPR Design 和 E-Crisp 可以预测哪些 gRNA 序列特异性最强，ZiFiT 不具有这种功能。但是由于这些预测位点周边的不确定性，研究人员仍然无法确保 gRNA 的严格特异性，因此专家们通常建议检测至少 3-5 个不同的 gRNA。这些序列可以通过例如 Sigma Aldrich 公司，或者 Integrated DNA Technologies 公司合成，每个费用大约为 10-20 美元。
 

虽然 Cas9 和 gRNA 能通过各自的质粒来表达，但是研究人员也可以选择在同一个质粒中表达 gRNA 和 Cas9，这对于难转染的细胞来说比较合适，比如免疫细胞。Addgene 公司也提供这种双表达质粒（价格为 65 美元）。不过为了快速地测试不同的gRNAs，研究人员可以利用 PCR 构建编码 gRNA 的 DNA 片段，其中包含激活表达的启动子，然后将这个片段与携带 Cas9 的质粒一同转染细胞。这种方法无需克隆 gRNA 表达质粒，可以节约两天时间，来自Broad研究院的张锋表示。
 

一旦你已经在细胞中表达了 gRNA 和 Cas9 酶，那么这一复合物就能完成余下的工作，轻而易举地切断靶标 DNA 的两条链。尽管细胞的 DNA 修复机制会试图修补片段，但是由于存在一个称为非同源末端连接（nonhomologous end joining）的过程，因此往往最终会删除或添加一个或两个核苷酸，造成移码突变，阻止基因表达。这样通过靶向基因起始位点的周围区域，研究人员就能阻断几乎所有的表达。
 

如何检测基因编辑的效率？

虽然 Cas9-gRNA 复合物作用强大，但是我们可能仍然希望能直接检测下这一工具是否正确突变了靶标，或者有没有出现脱靶的现象。这种方法与 ZFN 、TALEN不同——后两者通常需要检测许多融合蛋白，从中找到编辑靶标位点的那一个，CRISPR 方法则往往是利用尝试的第一个 gRNA 突变靶标，正如来自麻省总医院的病理学家 Keith Joung 说的那样，他的实验室检测的约 90% 的 gRNAs 都完成了目的靶标的突变。
 

然而，Cas9-gRNA 在避免脱靶方面并不是那么可靠，去年发表的少数研究表明，一些 gRNAs 出现了多达 5 次错配的脱靶问题。不过还有一些研究表明 gRNAs 的特异性也很强，未曾出现过一次脱靶。Joung 表示，虽然没有又快又好的方法来提高特异性，但我们可以挑选与潜在可能脱靶区域相似性最小的 gRNAs，来进行这项研究，CRISPR Design等程序可以实现这一点。
 

Cas9-gRNA 工具常用于失活许多细胞中的一个兴趣基因。研究人员可以通过证明这个基因产物无法表达，或者由于基因产物缺失而出现的某种细胞表型，来验证这个工具的作用。为了确保这些作用不是由于突变了脱靶位点造成的，我们可以利用一种 Surveyor assay 来直接分析 DNA 靶标位点，预测脱靶位点。这需要通过 PCR，以及一种特殊的酶（只切割带有突变的 PCR 产物）放大靶标位点，然后再将突变和未突变的 DNA 片段在琼脂糖凝胶中分离开来，突变的片段会小一些，因为它们被切断过。
 

这种方法也可以用于构建具有所有兴趣基因相同突变的克隆细胞系，或者来自敲除小鼠的小鼠细胞，为了完成这些任务，我们可能需要确保 Cas9-gRNA 复合物没有在未预测位点上引入一个突变。对于这些实验我们可能还需要进行整个基因组的高通量测序。
 

如何优化 gRNA 的特异性？

除了挑选与非靶标位点互补性最小的 gRNA 序列以外，还有两种可以减少脱靶效应的方法。
 

一个是转染的 Cas9 和 gRNA 表达质粒（或者 gRNA PCR 盒）数量尽可能的少，只要满足所必需的靶活性的最低量就行。因为这些浓度足以令靶标位点突变，就不会去突变非特异性位点，——脱靶活性通常比靶向活性要低。
 

另一种策略是采用 Cas9 的另外一种突变版本： Cas9 nickase，这种酶只会切割结合 gRNA 的那条 DNA 单链。正常的 Cas9 切割的是双链，单链缺口通常细胞会修补，但是如果细胞中表达的是 Cas9 nickase，以及与同一 DNA 靶标结合的一对 gRNAs，那么缺口上就能会出现突变。这种方法可以降低脱靶活性，因为不太可能两个 gRNAs 同时恰巧靠近脱靶位点。不过这种方法打靶效率可能会比正常 Cas9 和单个 gRNA 低。
 

要想消除所有的脱靶效应是不可能的，因为其中许多可能出现在基因组中的任何非编码区域。不过我们可以认为靶基因失活能引起可见的细胞效应，如果几个结合不同基因区域的 gRNAs 出现了相同的表型，那么就能假定具有不同的脱靶效应，Joung 说。通过表达质粒将基因引入细胞，恢复失活基因的表型也是一种不错的验证方法。
 

利用 Cas9-gRNA 系统还能做什么？

过去一年半的研究表明，Cas9-gRNA 系统可以用于多个方面，比如张锋实验室就利用这一系统，在细胞中同时表达了，来自不同表达质粒的5个靶向不同基因的 gRNAs，以及来自一个独立表达质粒的 Cas9，切割所有靶标位点。“靶向超过5个基因也是可能的”，张锋说。而要想利用 ZFN 和 TALENS 系统做到这一点，是不可想象的，因为靶向单独一个位点都要花费大量的人力物力。
 

除了失活基因，利用 Cas9-gRNA 还可以纠正基因。来自佐治亚理工学院的生物医学工程叫声包钢（Gang Bao，音译）正在朝着这方面努力，他尝试纠正一个破坏性的单核苷酸突变，患有镰刀状细胞贫血症的患者其 β-珠蛋白基因上的两个拷贝就出现了这种突变。研究人员利用 Cas9 nickase 和一对 gRNA 造成双缺口，同时将一个线性 DNA 片段转染进细胞中，片段大小通常为 400-800 碱基，也可以是能作为基因纠正模板的小质粒。
 

另外一个方面就是利用 Cas9 突变，这个突变并没有完全切割 DNA，而是与能开启或关闭基因表达的蛋白结构域融合。gRNA 可以指导这个修改后的 Cas9 到达正确的遗传元件，比如启动子和增强子，激活或抑制表达。这种用于基因抑制的方法被称为 CRISPRi，CRISPRi 已被证明比 RNAi（RNA 干扰）更为有效。

一个CRISPR只能加入一个20bp的片段是吗（只能加入到gRNA 5' 端区域）。我发现我买回来的质粒不是空的，那个位置已经加上了20bp的片段，我应该怎么把它去除然后加上我的片段呢，谢谢