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蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论 [精华]

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楼主

丁香园准中级站友

1楼

这个帖子发布于17年零201天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

从2D胶上挖下的点不少，可是就是无法得到理想的质谱结果，真是让人苦恼，各位做蛋白质组的同道，一起讨论一下，把您的经验和遇到的问题以及解决方案给大家介绍一下。
先在此提出一些问题
1，待作质谱分析的PAGE胶保存方法。
2，4度保存的PAGE胶半年时间（或其它时间）后还可以做质谱分析吗？
3，手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平，然后硅烷化。
4，切胶后是否一定需要切成1mm3的小块，如何切碎？切碎后如果被*头吸掉如何解决？
5，银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间，次数，脱色液成分等
6，使用碳酸氢铵缓冲液的浓度，25mM, 50mM, 100mM，经常使用哪个，感觉效果如何？
7，trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？
8，如何进行消化？
9，是否需要考虑溶胀凝胶用液体的体积？如果是，加trypsin的体积是多少？
10，加trypsin后是否应放4度一段时间，如果是，要多长时间？
11，如果加trypsin的体积太少，是否应补充碳酸氢铵buffer，以使凝胶充分溶胀？
12，消化用溶液的体积是否应该超过凝胶体积？即是否应该使凝胶完全浸没在溶液中？还是只要使凝胶充分溶胀即可，而不需浸没凝胶。
13，消化时间如何掌握？以使消化充分而自切峰少。
14，不同来源酶的效果如何？
15，从消化完的凝胶中抽提肽片段的方案。抽提溶液组成，抽提几次，抽提温度。超生对抽提帮助有多大？
16，抽提溶液抽真空方案。有人建议不要将抽提液完全抽干，是否有意义？因为如果一次抽很多样品，根本无法保证抽的速度完全一致，可能有的已干，而有的还有很多液体。
17，溶解抽干消化产物的方案。溶解液组成，加入量。如果作MALDI，是否可以将matrix solution直接加入抽干产物中。如果是作ESI，溶解液中使用TFA，而LC用溶液中使用甲酸，是否会对结果有影响？
18，MALDI点靶方案。
好了，暂时只想到这么多。各位同道可以针对以上问题提出自己的解决方案，也可以把自己的经验教训告诉大家，或者提出自己的问题。
谢谢丁香园提供这个空间，使我们能在此共同学习提高。

补充：可以检测到的蛋白量范围是多少？是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来？银染点鉴定效果如何？

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2003-08-22 00:53 浏览 : 8322 回复 : 33

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pengkp 编辑于 2003-08-22 00:57

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楼主

pengkp

丁香园准中级站友

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2楼

是因为丁香园里做蛋白质组的人不太多，还是各位不愿把自己的经验与大家分享，或者是近期内做蛋白质组的人不常来。
我先来个抛砖引玉吧。把我一些不成熟的做法给大家看看，肯定有很多疏漏之处以及有待改进的地方，请大家多提宝贵意见。
1，我一般是把染好的胶用水洗几遍，然后用保鲜膜包起来，放于4C。
2，我大多数胶点的质谱做得都不好，但有一次一个保存半年左右的样品竟然作出非常漂亮的ESI二级质谱。
3，切胶成小块很容易被*头吸走，所以我有时只是将凝胶切成较大块，而不切得太小。
4，使用常规考染脱色方法，银染用铁氰化钾和硫代硫酸钠。但考染脱色特别慢，不知有何高招可以加快。
5，NH4CO3浓度我经常使用25mM，文献中50mM和100mM也常见。Merck的产品介绍中声称可以使用无盐水进行消化。
6，我一般根据凝胶大小决定Trypsin使用体积，2－5ul之间。如果凝胶没有充分溶胀，我会再加一些buffer，4C放置后再把多余的液体吸掉（不知是否有必要）。
7，37C消化过夜是我最常用的选择。
8，我只用过Merck的TPCK modified trypsin。现在Merck新出了重组酶，另外Promega的酶经常在文献中看到，但没用过；好像现在Sigma也出了测序级胰酶。

2003-08-25 01:38