• 论坛首页
  • 我的丁香客
  • 找人
    查找好友
  • 更多
    丁香园
    丁香通
    丁香人才
    丁香会议
    丁香搜索
    丁香医生
    丁香无线
    丁香导航
    丁当铺
    文献求助
    医药数据库
    丁香诊所
    来问医生
登录 注册

蛋白质和糖学

关注今日：30 | 主题：444199
论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  蛋白质组学
  • 发帖
    每发1个新帖
    可以获得0.5个丁当奖励
  • 回帖

分享到：

  • 微信

    微信扫一扫

  • 微博
  • 丁香客
  • 复制网址

蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论 [精华]

  • 查看全部
  • 页码直达：
  • 直达末页
楼主 pengkp
pengkp
丁香园准中级站友

  • 46
    积分
  • 12
    得票
  • 229
    丁当
  • 1楼
这个帖子发布于17年零241天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
从2D胶上挖下的点不少，可是就是无法得到理想的质谱结果，真是让人苦恼，各位做蛋白质组的同道，一起讨论一下，把您的经验和遇到的问题以及解决方案给大家介绍一下。
先在此提出一些问题
1，待作质谱分析的PAGE胶保存方法。
2，4度保存的PAGE胶半年时间（或其它时间）后还可以做质谱分析吗？
3，手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平，然后硅烷化。
4，切胶后是否一定需要切成1mm3的小块，如何切碎？切碎后如果被*头吸掉如何解决？
5，银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间，次数，脱色液成分等
6，使用碳酸氢铵缓冲液的浓度，25mM, 50mM, 100mM，经常使用哪个，感觉效果如何？
7，trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？
8，如何进行消化？
9，是否需要考虑溶胀凝胶用液体的体积？如果是，加trypsin的体积是多少？
10，加trypsin后是否应放4度一段时间，如果是，要多长时间？
11，如果加trypsin的体积太少，是否应补充碳酸氢铵buffer，以使凝胶充分溶胀？
12，消化用溶液的体积是否应该超过凝胶体积？即是否应该使凝胶完全浸没在溶液中？还是只要使凝胶充分溶胀即可，而不需浸没凝胶。
13，消化时间如何掌握？以使消化充分而自切峰少。
14，不同来源酶的效果如何？
15，从消化完的凝胶中抽提肽片段的方案。抽提溶液组成，抽提几次，抽提温度。超生对抽提帮助有多大？
16，抽提溶液抽真空方案。有人建议不要将抽提液完全抽干，是否有意义？因为如果一次抽很多样品，根本无法保证抽的速度完全一致，可能有的已干，而有的还有很多液体。
17，溶解抽干消化产物的方案。溶解液组成，加入量。如果作MALDI，是否可以将matrix solution直接加入抽干产物中。如果是作ESI，溶解液中使用TFA，而LC用溶液中使用甲酸，是否会对结果有影响？
18，MALDI点靶方案。
好了，暂时只想到这么多。各位同道可以针对以上问题提出自己的解决方案，也可以把自己的经验教训告诉大家，或者提出自己的问题。
谢谢丁香园提供这个空间，使我们能在此共同学习提高。

补充：可以检测到的蛋白量范围是多少？是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来？银染点鉴定效果如何？
  • 邀请讨论

    • 不知道邀请谁？试试他们

    换一换
2003-08-22 00:53 浏览 : 8414 回复 : 33
  • 投票 3
  • 收藏 33
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
pengkp 编辑于 2003-08-22 00:57
  • • 新冠疫苗的奥秘——如何选择疫苗抗原？（转载）
楼主 pengkp
pengkp
丁香园准中级站友

  • 46
    积分
  • 12
    得票
  • 229
    丁当
  • +1 积分
  • 2楼
是因为丁香园里做蛋白质组的人不太多，还是各位不愿把自己的经验与大家分享，或者是近期内做蛋白质组的人不常来。
我先来个抛砖引玉吧。把我一些不成熟的做法给大家看看，肯定有很多疏漏之处以及有待改进的地方，请大家多提宝贵意见。
1，我一般是把染好的胶用水洗几遍，然后用保鲜膜包起来，放于4C。
2，我大多数胶点的质谱做得都不好，但有一次一个保存半年左右的样品竟然作出非常漂亮的ESI二级质谱。
3，切胶成小块很容易被*头吸走，所以我有时只是将凝胶切成较大块，而不切得太小。
4，使用常规考染脱色方法，银染用铁氰化钾和硫代硫酸钠。但考染脱色特别慢，不知有何高招可以加快。
5，NH4CO3浓度我经常使用25mM，文献中50mM和100mM也常见。Merck的产品介绍中声称可以使用无盐水进行消化。
6，我一般根据凝胶大小决定Trypsin使用体积，2－5ul之间。如果凝胶没有充分溶胀，我会再加一些buffer，4C放置后再把多余的液体吸掉（不知是否有必要）。
7，37C消化过夜是我最常用的选择。
8，我只用过Merck的TPCK modified trypsin。现在Merck新出了重组酶，另外Promega的酶经常在文献中看到，但没用过；好像现在Sigma也出了测序级胰酶。
2003-08-25 01:38
  • 投票 1
  • 收藏 2
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 疯长的肉瘤
楼主 pengkp
pengkp
丁香园准中级站友

  • 46
    积分
  • 12
    得票
  • 229
    丁当
  • 7楼
多谢daijie6，听君一席话，胜读十年书。:)
银染用H2O2脱色，会不会因为其氧化作用导致肽片段上的氨基酸残基被氧化，因为H2O2的氧化能力还是挺强的。
您认为H2O2更好是个人习惯，还是有具体的原因？

Q:trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？
A:看蛋白的量而定。一般为1:20，我觉得较理想。
如何对切下胶块进行定量？在有大量样品的情况下，每个样品都要分别对待，加不同量trypsin吗？
胶块大小和蛋白量不一定成比例，比如要使一个胶块充分溶胀要加10uL溶液，可是只要2ul trypsin（根据比例）。这时是否只加2ul trypsin，还是加完trypsin后再补充8ul buffer？如果要补充buffer，是等4C放置以吸收trypsin后再加，还是直接加入，然后4C放置？
2003-09-03 15:03
  • 投票
  • 收藏 2
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 2021【全科】中级考试集结地，欢迎讨论你的考后感受！
楼主 pengkp
pengkp
丁香园准中级站友

  • 46
    积分
  • 12
    得票
  • 229
    丁当
  • 8楼
hillson
我也要做质谱。想请以下试剂用哪个公司最好：胰蛋白酶　　乙腈　　DTT　碘乙酰铵　碳酸氢铵　甲酸　TFA
另外，做ESI-LC/MS用什么型号的柱子？请高人指教

普通化学试剂可以选用Sigma公司，
胰酶可从Roche或Promega获得，乙腈要用HPLC级，甲酸、TFA、NH4CO3我用Sigma的，DTT是Sigma、iodoacetylamide最早用Sigma的，现在我用acros的。ESI-LC/MS用HPLC柱子，联系质谱时他们会提供，一根柱子上万元，只做几个样品没必要买。
2003-09-03 15:12
  • 投票
  • 收藏 1
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 2021【内科】中级考试集结地，欢迎讨论你的考后感受！

关闭提示

需要2个丁当

丁香园旗下网站

  • 丁香园
  • 用药助手
  • 丁香通
  • 文献求助
  • 丁香人才
  • 丁香医生
  • 丁香导航
  • 丁香会议
  • 手机丁香园
  • 医药数据库

关于丁香园

  • 关于我们
  • 丁香园标志
  • 友情链接
  • 联系我们
  • 加盟丁香园
  • 版权声明
  • 资格证书

官方链接

  • 丁香志
  • 丁香园新浪微博
引用回复