会飘的雨
我在丁香园上曾经发过很多的帖子，有许多的关于CCK-8实验的救助的帖子，感谢曾经给予我答复的人，谢谢你们的帮助才使我完成了我实验的第一步。?我原以为做实验是一件很简单的事情，后来。。。?我做的CCK-8实验，所用细胞Hela（借用这个贴壁细胞），所用测试细胞活性，细胞毒性物质AgNPs（借用），所用降低Ag所致细胞毒性物质Vc（借用），所用试剂CCK-8试剂biosharp生产的国产CCK-8试剂（国产的，以前师兄留了同仁的，用光了），用的血清四季青（感觉还不错）?不废话，详细的实验流程写下，一些小技巧写上，一些注意点奉上。?1.细胞接种96孔板。 从9孔板的第2列可以接种到第11列，从B行可以接种到G行，最外面一圈加PBS（防止放入培养箱把96孔板中的细胞培养液挥发），每个孔建议不少于2*10的4次方，不多于10*10的4次方。每个孔100ul，沿着孔的内壁加入，这样就比较好加入，且不用再摇匀。接种3个96孔板，为下面实验做准备。?2.细胞培养24h，时间不定，待细胞长到70%-80%时可以进入下一步，若细胞培养48h的，建议换液?3.做预实验的第一步：测定AgNPs对细胞毒性的浓度大小，加入不同浓度AgNPs毒性物质与空白组对照，测定IC50半数致死量，选择不同时间来测定IC50，以4h，6h，12h，18h，24h，48h最为常见，大家可以任意选择，时间点不同半数致死量IC50肯定不一样，上述3块96孔板，就选择3个不同时间检测。?A.将1中的接种细胞的培养液完全吸出来，1中用100ul*接种，现在就用200ul*吸出（可以较为完全吸出），此处有一个在实验中会出现的问题，在用200ul*吸出时，吸几次后在墙头处会有气泡，很多的气泡堆积，此时再吸时容易在孔底留有气泡，此时还要换*头，比较烦人，此处有一个小方法，用一个2ml的冻存管，里面加入2mlPBS，当有气泡时，把*头顶端沾入冻存管的PBS中，此时气泡就消失了，也不用换*头了。?B.将配好的不同浓度AgNPs溶液（怎么配一个颗粒将其比那成溶液怎么计算此处不做进一步解释，我放一个链接http://www.dxy.cn/bbs/topic/30895859）加入第3列到11列，具体几列看你具体几个浓度，每一列一个浓度，第2列作为对照组，不加入AgNPs，只加入基培（基础培养基，没有血清）因为完培会影响酶标仪读数，我觉得会使读数变小，有人说变大。将3个96孔板全部接种，然后每个孔板培养不同的时间。?C.按24h来做的话，那么当B中的AgNPs接种了20h的时候加入CCK-8试剂，每个孔加入10ul（加CCK-8时，10ul不好加，此时沿着孔内壁与液平面交界处加入比较容易加入），然后每隔一段时间，15min，30min将其放入酶标仪测读数（用酶标仪找人教），CCK-8最后测读数别超过4h，我觉得读数在空白组（即第2列，因为第2列按理论来说读数应该最大）最好为1.2.3，别超过4，选择半数找出半数致死量?D.若半数致死量没有找到，则要扩大或者减小所测试的AgNPs的浓度，再重1重新开始做起?下次再说加入减毒物质，测定减毒物质的浓度?
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