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细胞技术

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论坛首页  >  细胞技术讨论版   >  【专题|总结】
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【原创】CCK-8实验:细胞活性实验(MTT实验的简单化),毒性实验,加药实验,预实验的自己走过的路

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楼主 会飘的雨
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这个帖子发布于5年零270天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我在丁香园上曾经发过很多的帖子,有许多的关于CCK-8实验的救助的帖子,感谢曾经给予我答复的人,谢谢你们的帮助才使我完成了我实验的第一步。
我原以为做实验是一件很简单的事情,后来。。。
我做的CCK-8实验,所用细胞Hela(借用这个贴壁细胞),所用测试细胞活性,细胞毒性物质AgNPs(借用),所用降低Ag所致细胞毒性物质Vc(借用),所用试剂CCK-8试剂biosharp生产的国产CCK-8试剂(国产的,以前师兄留了同仁的,用光了),用的血清四季青(感觉还不错)
不废话,详细的实验流程写下,一些小技巧写上,一些注意点奉上。
1.细胞接种96孔板。 从9孔板的第2列可以接种到第11列,从B行可以接种到G行,最外面一圈加PBS(防止放入培养箱把96孔板中的细胞培养液挥发),每个孔建议不少于2*10的4次方,不多于10*10的4次方。每个孔100ul,沿着孔的内壁加入,这样就比较好加入,且不用再摇匀。接种3个96孔板,为下面实验做准备。
2.细胞培养24h,时间不定,待细胞长到70%-80%时可以进入下一步,若细胞培养48h的,建议换液
3.做预实验的第一步:测定AgNPs对细胞毒性的浓度大小,加入不同浓度AgNPs毒性物质与空白组对照,测定IC50半数致死量,选择不同时间来测定IC50,以4h,6h,12h,18h,24h,48h最为常见,大家可以任意选择,时间点不同半数致死量IC50肯定不一样,上述3块96孔板,就选择3个不同时间检测。
A.将1中的接种细胞的培养液完全吸出来,1中用100ul*接种,现在就用200ul*吸出(可以较为完全吸出),此处有一个在实验中会出现的问题,在用200ul*吸出时,吸几次后在墙头处会有气泡,很多的气泡堆积,此时再吸时容易在孔底留有气泡,此时还要换*头,比较烦人,此处有一个小方法,用一个2ml的冻存管,里面加入2mlPBS,当有气泡时,把*头顶端沾入冻存管的PBS中,此时气泡就消失了,也不用换*头了。
B.将配好的不同浓度AgNPs溶液(怎么配一个颗粒将其比那成溶液怎么计算此处不做进一步解释,我放一个链接http://www.dxy.cn/bbs/topic/30895859)加入第3列到11列,具体几列看你具体几个浓度,每一列一个浓度,第2列作为对照组,不加入AgNPs,只加入基培(基础培养基,没有血清)因为完培会影响酶标仪读数,我觉得会使读数变小,有人说变大。将3个96孔板全部接种,然后每个孔板培养不同的时间。
C.按24h来做的话,那么当B中的AgNPs接种了20h的时候加入CCK-8试剂,每个孔加入10ul(加CCK-8时,10ul不好加,此时沿着孔内壁与液平面交界处加入比较容易加入),然后每隔一段时间,15min,30min将其放入酶标仪测读数(用酶标仪找人教),CCK-8最后测读数别超过4h,我觉得读数在空白组(即第2列,因为第2列按理论来说读数应该最大)最好为1.2.3,别超过4,选择半数找出半数致死量
D.若半数致死量没有找到,则要扩大或者减小所测试的AgNPs的浓度,再重1重新开始做起
下次再说加入减毒物质,测定减毒物质的浓度
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2015-06-03 17:36 来自 Android客户端 浏览 : 16827 回复 : 22
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yj1984ren 编辑于 2015-06-03 18:22
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以后我会做细胞凋亡,western等试验,等试验做完我会奉上自己的实验之路,希望能帮助大家,同时也希望大家能畅所欲言,在我不懂的时候能够帮助我
2015-06-03 17:38
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我在丁香园上曾经发过很多的帖子,有许多的关于CCK-8实验的救助的帖子,感谢曾经给予我答复的人,谢谢你们的帮助才使我完成了我实验的第一步。?我原以为做实验是一件很简单的事情,后来。。。?我做的CCK-8实验,所用细胞Hela(借用这个贴壁细胞),所用测试细胞活性,细胞毒性物质AgNPs(借用),所用降低Ag所致细胞毒性物质Vc(借用),所用试剂CCK-8试剂biosharp生产的国产CCK-8试剂(国产的,以前师兄留了同仁的,用光了),用的血清四季青(感觉还不错)?不废话,详细的实验流程写下,一些小技巧写上,一些注意点奉上。?1.细胞接种96孔板。 从9孔板的第2列可以接种到第11列,从B行可以接种到G行,最外面一圈加PBS(防止放入培养箱把96孔板中的细胞培养液挥发),每个孔建议不少于2*10的4次方,不多于10*10的4次方。每个孔100ul,沿着孔的内壁加入,这样就比较好加入,且不用再摇匀。接种3个96孔板,为下面实验做准备。?2.细胞培养24h,时间不定,待细胞长到70%-80%时可以进入下一步,若细胞培养48h的,建议换液?3.做预实验的第一步:测定AgNPs对细胞毒性的浓度大小,加入不同浓度AgNPs毒性物质与空白组对照,测定IC50半数致死量,选择不同时间来测定IC50,以4h,6h,12h,18h,24h,48h最为常见,大家可以任意选择,时间点不同半数致死量IC50肯定不一样,上述3块96孔板,就选择3个不同时间检测。?A.将1中的接种细胞的培养液完全吸出来,1中用100ul*接种,现在就用200ul*吸出(可以较为完全吸出),此处有一个在实验中会出现的问题,在用200ul*吸出时,吸几次后在墙头处会有气泡,很多的气泡堆积,此时再吸时容易在孔底留有气泡,此时还要换*头,比较烦人,此处有一个小方法,用一个2ml的冻存管,里面加入2mlPBS,当有气泡时,把*头顶端沾入冻存管的PBS中,此时气泡就消失了,也不用换*头了。?B.将配好的不同浓度AgNPs溶液(怎么配一个颗粒将其比那成溶液怎么计算此处不做进一步解释,我放一个链接http://www.dxy.cn/bbs/topic/30895859)加入第3列到11列,具体几列看你具体几个浓度,每一列一个浓度,第2列作为对照组,不加入AgNPs,只加入基培(基础培养基,没有血清)因为完培会影响酶标仪读数,我觉得会使读数变小,有人说变大。将3个96孔板全部接种,然后每个孔板培养不同的时间。?C.按24h来做的话,那么当B中的AgNPs接种了20h的时候加入CCK-8试剂,每个孔加入10ul(加CCK-8时,10ul不好加,此时沿着孔内壁与液平面交界处加入比较容易加入),然后每隔一段时间,15min,30min将其放入酶标仪测读数(用酶标仪找人教),CCK-8最后测读数别超过4h,我觉得读数在空白组(即第2列,因为第2列按理论来说读数应该最大)最好为1.2.3,别超过4,选择半数找出半数致死量?D.若半数致死量没有找到,则要扩大或者减小所测试的AgNPs的浓度,再重1重新开始做起?下次再说加入减毒物质,测定减毒物质的浓度?
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谢斑竹
2015-06-03 20:04 来自 iPhone/iPad客户端
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上次说加入了毒性物质,AgNPs,并且通过CCK-8实验测出了Ag纳米颗粒导致细胞死亡的半数致死量IC50,现在加入减毒物质Vc(减轻由AgNPs导致的细胞死亡),找出其Vc作用的浓度
1.如1楼中的1所说,细胞接种96孔板
2.一般大概24h,看细胞密度在70%-80%之间,加入毒性物质与减毒物质,此处有多种加入方法,主要为:一种(称为A),在细胞培养24h后,先加入不同浓度的Vc(抗氧化剂一种)预培养1h,然后再加入所获得的不同时间的半数致死量浓度毒性物质AgNPs(不同时间,那么其半数致死量也不一样,因此也就多了几块96孔板,当然,为了减少麻烦,也可只做一个时间)。另一种(称为B),在细胞培养24h后,将AgNPs与Vc同时加入一起培养(其混合液的AgNPs浓度最终要求是1楼所最终测出的半数致死量的浓度,此处不可以先半数致死量浓度的AgNPs溶液混合不同浓度的Vc溶液,因为混合后Ag与Vc的浓度均会变小,具体的配法下面会讲)
A.也就是先Vc预培养1好,再加入AgNPs,在此我看过前辈很多的帖子,在此我做总结:先加入Vc高浓度(相较实验要求的10mmol/l,那么我加入20mmol/l)共100ul预培养1h,然后加入高浓度的AgNPs(实验要求500umol/l,那么我加入1000umol/l)共100ul将其混合,此时,混合后AgNPs与Vc的浓度都变成500umol/l与10mmol/l(符合实验的要求了)混合后培养24h,或者48h,具体培养时间大家自己寻找,我建议最好24h的,时间既不短也不长,同时不需要涉及换液问题,在混合培养20h时加入20ulCCK-8试剂(96孔板CCK-8试剂的计算方式是10:1,10的溶液,1的CCK-8),培养时间不超过4h,每15min,30min读数。
问题来了,经过本来自己的实验发现,这么做实验设计没错,但实验长会遇到很多的问题
AgNPs以及Vc溶液,那么这种溶液该怎么配,这些Vc,AgNPs开始都为固体或者粉末状态,要变成溶液需要基培、PBS、纯水、DMSO、这些东西来配成溶液(这些都是我从丁香园上总结看到的大家选择的液体)。
首先基培(为什么用基培不用完培,我们做实验要停止细胞的生长,让细胞保持现在的装填又不至于饿死,其次,血清会影响CCK-8读数):用基培配,优点:应该解决了接种后细胞没有基础营养的问题,同时缓解了加入Vc等抗氧化剂溶液酸性特别强的问题(PH值问题,细胞生长环境宗傲PH值7.1左右,具体多少忘记),至少比纯水好的多。缺点:20ml,甚至50ml基培配成溶液供使用,浪费,同时不确定AgNPs与基培中的蛋白会不会有反应,这个我看到前辈有说做预实验观察解决这个问题的,我不做评论,因为我不知道怎么做。
PBS(我认为最优选择):优点:如基培一样,至少比纯水能缓冲PH值的问题,相较于基培虽然两者价格差不多,但基培用处更多,使用的更快,一般大家实验谁买的最多的肯定是基培,PBS可以用好久,同时解决了基培中的蛋白与AgNPs反应的问题。缺点:不能给细胞生长提供营养,这点没基培好,也是浪费钱
纯水:优点:不要钱。缺点:PH值问题最严重,没有营养。此处我认为应该纯水是最好别用
DMSO:优点:长期保存Vc溶液最好DMSO,本人没做过研究,不做评论
废话不多说,选择A的实验中会遇到的问题
第一个:使用双倍浓度的AgNPs与Vc溶液,我们不考虑浪费PBS等问题,这个无关紧要,在这里需要说一个母液问题,给大家个链接http://www.dxy.cn/bbs/topic/30895859。我只需要把母液稍微稀释一点,变成原来的双倍就好了,那么这里稀释的时候是加基培(考虑细胞营养问题),我们都知道稀释越少,那么基培越少,营养也就越少,营养都没有了,你这细胞究竟是毒死的还是饿死的我不敢确认
第二个:20ulCCK-8试剂,大家知道CCK-8试剂多贵,比抗体便宜是肯定的,但有比亚这么浪费吗?有人说各50ul总100ul,有没有想过这个基培会更少,饿死的更多
第三个:你分两次加,其实也就是对细胞的2次影响,我觉得2次影响肯定是对细胞有影响的,至少比1的的大
综上所述我认为方案B更好
下面我会接着说方案B的具体操作
2015-06-04 15:17
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