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蛋白质和糖学

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论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  Western Blot/IP
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【求助】Western-Blot转膜时的transfer buffer配方

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楼主 边小边
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这个帖子发布于5年零238天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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求 Western-Blot 转膜用的10×Transfer Buffer 配方。
我在网上查到两个配方版本:都含有甘氨酸和Tris,只是
第一种:不含SDS
第二种:含SDS(0.37%)
求教各位,SDS在转膜时的作用,浓度或高或低会对转膜有什么影响呢?
我用的是PVDF膜进行湿转和半干转,湿转和半干转用的Transfer Buffer一样吗?需要调PH吗?
悬赏急求答案,希望懂得人详细讲解一下,不胜感激
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2015-05-27 17:10 浏览 : 33958 回复 : 3
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hbezyr
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    丁当
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acrolijun
求 Western-Blot 转膜用的10×Transfer Buffer 配方。
我在网上查到两个配方版本:都含有甘氨酸和Tris,只是
第一种:不含SDS
第二种:含SDS(0.37%)
求教各位,SDS在转膜时的作用,浓度或高或低会对转膜有什么影响呢?
我用的是PVDF膜进行湿转和半干转,湿转和半干转用的Transfer Buffer一样吗?需要调PH吗?
悬赏急求答案,希望懂得人详细讲解一下,不胜感激


可以参见
Transfer Buffers
Common buffers used for Western blotting are:
  • Towbin system buffer (25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM glycine, 20% (v:v) methanol)
  • CAPS buffer system (10 mM CAPS pH 10.5, 10% (v:v) methanol)
In most experiments, SDS should be omitted from the Western transfer buffer because the negative charge imparted to proteins can cause them to pass through the membrane. Typically, there is enough SDS associated with the proteins in SDS-PAGE gels to effectively carry them out of the gel and onto the membrane support. For proteins that tend to precipitate, the addition of low concentrations of SDS (<0.01%) may be necessary. It should be noted that adding SDS to the transfer buffer may require optimization of other transfer parameters (e.g., time, current) to prevent over-transfer of the proteins through the membrane (also known as "blowout").
Methanol in the transfer buffer aids in stripping the SDS from proteins in SDS-PAGE gels, increasing their ability to bind to support membranes. However, methanol can inactivate enzymes required for downstream analyses and shrinks the gel and membrane, which may increase the transfer time of large molecular weight proteins (150,000 Da) with poor solubility in methanol. In the absence of methanol, though, protein gels may swell in low ionic strength buffers, and therefore it is recommended to pre-swell gels for 30 minutes to 1 hour to prevent band distortion.
详细见https://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html
2015-05-27 17:25
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hbezyr
可以参见
Transfer Buffers
Common buffers used for Western blotting are:
  • Towbin system buffer (25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM glycine, 20% (v:v) methanol)
  • CAPS buffer system (10 mM CAPS pH 10.5, 10% (v:v) methanol)
In most experiments, SDS should be omitted from the Western transfer buffer because the negative charge imparted to proteins can cause them to pass through the membrane. Typically, there is enough SDS associated with the proteins in SDS-PAGE gels to effectively carry them out of the gel and onto the membrane support. For proteins that tend to precipitate, the addition of low concentrations of SDS (<0.01%) may be necessary. It should be noted that adding SDS to the transfer buffer may require optimization of other transfer parameters (e.g., time, current) to prevent over-transfer of the proteins through the membrane (also known as "blowout").
Methanol in the transfer buffer aids in stripping the SDS from proteins in SDS-PAGE gels, increasing their ability to bind to support membranes. However, methanol can inactivate enzymes required for downstream analyses and shrinks the gel and membrane, which may increase the transfer time of large molecular weight proteins (150,000 Da) with poor solubility in methanol. In the absence of methanol, though, protein gels may swell in low ionic strength buffers, and therefore it is recommended to pre-swell gels for 30 minutes to 1 hour to prevent band distortion.
详细见https://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html
湿转和半干转用的Transfer Buffer一样吗?需要调PH吗?
2015-05-28 08:41
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大南
大南
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现在转膜有三种 (按时间分)
1快转:10分钟,以life的IBLOT和Bio-Rad的Turbo为佳,缺点就是贵,优点比湿转好的就是条带不容易变形,thermo出快转溶液,较为便宜但效果差(比半干转好)。
2半干转:1小时,类似湿转,只是国内自己的山寨(可能应该是创新)的小仪器,溶液基本照搬湿转的,效果最差,但是操作简便,省溶液。
3湿转:1-2小时,效果最好,操作最烦,耗时耗溶液,溶液国内配方基本是tris-Glycine,也有其他种类,但是做了这么多少年的实验,试过效果并不高于tris-Glycine,加SDS的配方效果并不提升多少,但是会引入细细的泡沫造成麻烦,加减甲醇(一定要甲醇,乙醇效果差)也没有明显改善的效果,不如降低温度延长时间来的好。
2015-05-28 13:16
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