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关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题？ [精华]

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楼主

cpu随风而逝

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1楼

这个帖子发布于4年零229天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

如题，碰到的个问题，我用制备型HPLC分别分离收集酸碱性异构体，按照主峰峰谷收集，之后进行浓缩，去分析型检测，所用柱子介质一致，只是体积不同。如图所示结果虽然酸性异构体中酸性组分明显变多，但仍存在目的组分。目的组分纯度将近100，收集的碱性异构体更加神奇，酸性组分与碱性组分均增加。，目的组分的出现比较合理，收集碱性组分时，不应该还存在酸性组分。所以请教各位大神，是否有看到类似文献说酸碱性异构体之间会相互转换？
我个人知识，也许会有转换，比如C端赖氨酸存在显碱性峰，过程中被切除变成酸性异构体？只是原先结果显示该蛋白赖氨酸已经大部分被切除，，

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2014-04-02 14:18 浏览 : 32598 回复 : 62

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horizon801 编辑于 2015-08-28 20:02

• 【考研倒计时活动】倒计时 40 天：说说你考研路上遇到的困难，赢日历与丁当！

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楼主

cpu随风而逝

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丁香园准中级站友

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32楼

lxmouse84
这个话题有点意思啊，有持续的关注。charge variants的分离我觉得还是displacement chromatography效果最好。另外，这个图谱确实不正常，整体偏右。现在国内做抗体药的，都没有人是全部都懂的，做培养的也许只知道发酵，但是对蛋白质的性质完全不了解，做纯化的也未必深度了解蛋白质。药物分析这块呢多数是以前做小分子的，后来转做大分子，方法虽然大同小异，但是蛋白质的复杂性决定了分析的复杂。每个部分如果没有一个牛人支持，基本就搞不成。7楼这个确实很有意思，我以前确实碰到过这种蛋白，离子柱可以分得很好，但是后面每一个单独组分再分析又变了，不过这样的抗体确实没碰到过。按道理，抗体的charge variant虽然有多种成因，但是在下游纯化完成后最容易发生的也就是oxidation和deamidation了，有些可能还有Asp的isomerization啥的。如果真像7楼说的，倒是可以分析抗体里面是否含有这种金属离子导致构象出现了变化。

一年多过去了，看到这么多战友持续关注，感到很欣慰。电荷异构体的课题也做完啦，感谢各位战友给予的帮助。

最终分离的样品
对于最初提的问题，做个总结，欢迎补充讨论。
1、分离方法：最开始分离电荷异构体时，考虑过用置换色谱（displacement chromatography），也有相应的文献参考，找到了置换剂，但置换剂过贵，且仍需检测置换剂的残留，最终放弃这个方法，改用半制备的离子交换柱，与分析型的一致，也有利于直观观察收集。不过此方法收集量小，做常规分析够用。若准备做细胞活性分析及动物实验，建议直接去探索置换色谱吧。分离后，样品的保存很关键，后续的检测方法条件也值得推敲。
2、关于图谱偏右：偏右的原因还是因为上样量亦或是分离条件受限，尝试过降低上样量，峰型对称因子变好，但由于微小的组分分辨差，导致比例差异大。尝试过加大洗脱液离子强度，也同样能形成不拖尾的峰，但同样也易使碱性峰被洗脱，影响分析结果。综上，受限于离子性质过近，某些翻译后修饰量甚小，选择分离条件时要平衡这些因素。个人感觉，原则上能表征CQA，同时方法耐受性、重复性等等均符合。
3、酸碱性成因： 24楼 jackieustc 提到了类克的酸碱性峰主要的形成原因，但如氧化、异构化等并未提及。我所做的抗体结果显示，酸性峰主要由脱酰胺、唾液酸、蛋氨酸组氨酸氧化、异构化等，碱性峰主要有赖氨酸、氧化、多聚、man5等导致，酸碱性峰中性糖差异也显著，如G0 G1F man5，这些中性糖是否会通过构象影响与柱子的结果，现在也不得而知，已有多篇报道，并未得到一致结果。
4、酸碱性峰的转化：关于转化，主要牵扯到的是哪种翻译后修饰占主导。如唾液酸使抗体带负电，而赖氨酸会使抗体增加一个正电荷，若抗体同时存在唾液酸及赖氨酸，情况又会是如何？两个赖氨酸存在下，会增大两个电荷，因而主要是碱性效应。若在培养纯化等过程，赖氨酸被切除，碱性异构体就会转化成酸性异构体。7楼提到的CU离子，最终影响的也是赖氨酸的形成。在课题中遇到酸碱性异构体中255位蛋氨酸氧化明显、经CPB处理后，碱性减少,酸性第一峰比例增加；经双氧水处理后，酸性第一峰同样增加显著。这些现象似乎就能说明，对于此抗体255位蛋氨酸氧化导致构象改变，形成酸性异构体，但若末端赖氨酸存在，正电荷效应更加显著，最终主要显示碱性峰效应。受限于仪器条件，证明过程并为深入研究。
几点建议： 1、关注聚体，聚体主要显示碱性，对离子分布、疏水分布及后续的活性实验都有很大影响。因为做碱性分析时，最好排除聚体干扰。
2、疏水色谱在行业内并为得到较好的应用，但是其在表征PTM尤其是异构化，氧化等作用很显著。
3、多读文献，由于PTM太过复杂，文献的积累很重要。当年提这个问题时啥都不懂，看了不下百篇文献后，很多问题都已经心中有底，只缺实验验证。

2015-08-10 13:03

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ylhuang0502

丁香园荣誉版主

+1 积分

热

7楼

楼主提出了一个很有意思的问题。综合楼主和楼上站友们的意见，我的看法如下：

色谱左拖尾很可能是由于样品浓缩后上样量太大引起的。
酸碱组分在第一步分离的效果确实不够好，但是无论如何差，都不能解释为何“碱性异构体更加神奇，酸性组分与碱性组分均增加”
上述貌似神奇的现象很可能确如楼主推测的：“酸碱性异构体之间会相互转换”。至少碱性成分可以转化为酸性成分。在楼主浓缩过程中，有些影响酸碱性异构体的成分（如铜离子）会大大增加，从而导致碱性成分转化为酸性成分。
支持文献：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3242844/
上述文献相关关键结果：“While the acidic charge variant profile remained unchanged for all copper concentrations, the relative abundance of certain basic peaks increased with increasing copper concentration over the range tested。”
单抗电荷异构体的形成原因有很多（Heterogeneity in mAbs is represented by charge variants, typically caused by deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, sialylation, N-terminal pyroglutamic acid or C-terminal lysine (Lys) clipping）。所以有许多可能的因素会导致碱性成分转化为酸性成分。

版主zhulikou431留言:
加分鼓励。

2014-11-29 00:02

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zhulikou431 编辑于 2014-12-13 16:08

• 呼吸困难5天，入院第2天死亡

yww2012

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5楼

不知你上样量是多大，还有你的分析方法好像不好吧，看过很多色谱图，很少看见像你这样的色谱图，均向右倾斜，并且，右面几乎不拖尾，一般的色谱图要是拖尾都是右变的；另外酸碱组分很难分开的，等电点一般就差0.1，不过如果你分离方法好的话，还是可以得到的，见过文献上的分析图谱，分离效果不错，后面2个碱性峰的保留时间能相差1min左右，人家用的是WCX。

版主zhulikou431留言:
鼓励新手。

2014-11-27 21:04

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zhulikou431 编辑于 2014-12-13 16:08

• 考研忘了现场确认，回来说说感受。

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