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【经验】如何把液相做到“打游戏” [精华]

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楼主

谢沐风

未知

铁杆站友

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1楼

这个帖子发布于7年零67天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

如何把液相做到“打游戏” 上海市食品药品检验所谢沐风（xiemufeng@sina.com）液相色谱仪是药物分析工作者最常用的“一门武器”。本人工作15.5年，深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能庖丁解牛般使用，便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。
一、水相中的溶质溶解方式
水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因此种方式的溶解，溶质可能处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等），极易析出少量结晶；而一旦析出，便将损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。
二、流动相的配制与使用
1. 恒度洗脱
一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的原则。切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。
剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后抽滤即可。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。实践是检验真理的唯一标准！实践吧~
2. 梯度洗脱
流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为低比例的水相-高比例的有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。
梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。
三、色谱柱的安装
标准SOP应为：取A管路放入流动相瓶中→拧松泵头→流速由0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒→拧紧泵头→流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5秒→流速逐步降至1.0ml/min →安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端→手握两端螺丝帽，拧紧。
以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6秒以内。
四、试验后色谱柱的清洗
1. 最为常用的C₈柱、C₁₈柱
1.1 流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时
继续冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温保持试验时温度，即可。
1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时
先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。
很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗，实属画蛇添足，导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000元的色谱柱，正着用了四年、倒着用了两年（倒着用测非有关物质）。
2. 其他类型色谱柱
查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则导致色谱柱性能急剧下降。
五、试验顺序
工作流程应如下进行：
(1) 0~2小时配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。
(2) 2~3小时采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1小时后即可开始做试验。
(3) 3~5小时测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定得过小，使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。
(4) 5~8小时配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。切勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。
(5) 9~24小时放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定的样品（配制一份测定一针）。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、镇定自若。如单位还无自动进样装置，建议向领导申请购买，因一台自动媲美三台手动。
(6) 第二天0~0.5小时检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。
(7) 第二天0.5~2.0小时如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。
六、液相软件的使用
现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。
建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“磨刀不误砍柴工”：本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~
七、其他
1. 如需使用正相系统，一定要单独采用一台仪器（如二手的、较为破旧的、淘汰的等），切勿采用异丙醇转换，此举对仪器损伤极大，等于“自杀”。
2. 正相所使用的流动相（如正己烷、环己烷等），无需抽滤，混匀超声后即可使用，“大道至简”。
3. 柱温箱必须配制。如欲经济，可购买国产柱温箱。
（欢迎众人补充完善……）
2013年12月

如何把液相做到“打游戏”.pdf(23.77k)

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2013-12-22 14:49 浏览 : 28973 回复 : 116

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xiemufeng 编辑于 2015-10-22 08:47

• 【经验分享】要就业了，工作单位怎么选？

楼主

谢沐风

未知

铁杆站友

18楼

“仔细”同仁：
晚上好！建议如下：
1. N年前的色谱柱性能不佳，才有如此规定。现今的色谱柱早已今非昔比，但书本上的知识却一直未能更新，有些抱残守缺，如此而已。
2. 不建议思考异丙醇转换的不适，就固定另一台仪器进行正相试验为最佳方案。
祝顺利！
上海药检所谢沐风问候 2013-12-23

2013-12-23 21:27

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• 落枕诊治

楼主

谢沐风

未知

铁杆站友

19楼

wutao2013
请讲讲色谱柱的保养和使用吧，这方面感觉国内色谱柱质量真差，另外，卖给药检所和企业的色谱柱也有质量上的显著差异，郁闷￥￥￥

“wutao2013”同仁：
晚上好！本人不同意您的观点：这方面感觉国内色谱柱质量真差（我从未听说，也无切身感受），另外，卖给药检所和企业的色谱柱也有质量上的显著差异（这一点更是有些捕风捉影）。
还是您在使用和保养色谱柱时操作不规范，有不合理的地方。请静心厘清每一细节，即可解决。祝顺利！
上海药检所谢沐风问候 2013-12-23

2013-12-23 21:32

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• 牙龈小泡与小包，根尖周炎要注意

楼主

谢沐风

未知

铁杆站友

+1 积分
28楼

学工
拜读大作《如何把液相做到“打游戏”》后，深感获益良多，目前，我部门柱子消耗严重，平均每月一根！谢老师的经验无疑是雪中送炭，谢谢！
不过，个人有些疑问，请不吝赐教。
1.请问您用的柱子品牌型号？使用频率？是专用还是共用？
2.剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处——是放冰箱里？我放在室内约半个月里面出现短纤毛状物,重新滤又怕改变了比例，只好弃去。
3.易溶于水的表面活性剂（如烷基磺酸钠类）有必要加热配制流动相么？含表面活性剂流动相前一晚小流速过夜是基于何原因呢？
请谢老师百忙中答复一下，鄙人不胜感谢！

“学工”同仁：
晚上好！建议如下：
1. 请问您用的柱子品牌型号（十分常用的Kromasil柱子）？使用频率（几乎每天）？是专用还是共用（个人专用）？
2. 剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处——是放冰箱里（无需，放在阴凉处即可）？我放在室内约半个月里面出现短纤毛状物（应该不会，其中有有机相，一般不会长东西？是您疑神疑鬼了吧！或是您溶解水相中的溶质时未采用加热法，导致少量析出），重新滤又怕改变了比例（过于谨小慎微了，浪费了多可惜！用乙腈像喝水一样，呵呵~~），只好弃去。
3. 易溶于水的表面活性剂（如烷基磺酸钠类）有必要加热配制流动相么（有必要，加热到70~80℃，边加热便搅拌，直至“肥皂泡”下的液体澄清透明，但勿需到煮沸）？含表面活性剂流动相前一晚小流速过夜是基于何原因呢（因含有表面活性剂，整个系统平衡时间较长）？
祝试验顺利！
上海药检所谢沐风问候 2013-12-24

2013-12-24 22:15

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xiemufeng 编辑于 2013-12-25 19:44

• （原创）6小时抢救成功1例呼吸65次/分昏迷的患者

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