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【专题讨论】Western blotting实验细节剖析（欢迎有经验的战友参与交流和分享，加分和投票鼓励！！） [精华]

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liqin1013

入门站友

36楼

抗体就算在-80度也保存不了几个月啊

2013-12-21 16:49

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• 实话实说，非常典型的病例，走过路过，千万…别错过（手术，有结果）

qqminmin

肝胆外科

入门站友

37楼

请教，我要做130KDa和140KDa的Western，之前在丁香园上看建议转膜300mA恒流，分别转130min和140min，但是一直没出结果，今天分别转了150min和180min，之后用立春红染色，膜上什么都没有，请问可能是什么原因，转膜液已经提前预冷，甲醇的量也加多了，冰上转膜。
PS：另外还有一个奇怪的事情，今天电泳的时候Marker的条带不见了，直到大概55KDa才能看到，我上了5μMarker，以前上这么多都能看到的是的

2013-12-24 23:52

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• 死亡患者危重讨论怎么写？

曾想仗剑天涯

科室保密

丁香园准中级站友

38楼

最近在做MDCK细胞蛋白的Western
目的蛋白在75，76kDa结果不是好
条件蛋白上样量100ug,1xbuffer,共20ul,积层胶约15分钟，分离胶约2小时，NC膜半干转25v,30min.
一抗1：100 2ul:200ul 分别为兔和鼠来源，二抗1：300 1ul:300ul 羊抗兔和兔抗鼠，
出来的条带距目的条带位置偏小，杂带也不少，其中一号泳道出现很多斑点？二抗孵育的时候没晃匀？我是把转好膜后，在距离目的条带左右把膜上下剪掉，所以孵一抗的时候就只加了200ul一抗稀释液，只是把膜湿润了，不能在保鲜膜里晃动，一，三号泳道目的条带应该在75，76kD，但位置不对，这样有意义么，换marker?
actin无杂带，清晰。