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【专题讨论】Western blotting实验细节剖析（欢迎有经验的战友参与交流和分享，加分和投票鼓励！！） [精华]

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楼主

wh2008

丁香园中级站友

+2 积分
1楼

这个帖子发布于7年零72天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

WB技术已经成为许多实验室的常规分子生物学方法，但该实验也存在许多细节，稍不注意也可产生假结果，现在与大家一起探讨实验细节。
讨论主题：

1、显影为阴性结果的原因有哪些？
2、显影有杂带或背景的原因有哪些？
3、加发光液光消退的原因有哪些？
4、一抗或二抗的选择要点和抗体孵育要点是什么？
5、封闭液的选用要求是什么？
6、膜选择和转膜条件如何优化？
7、胶浓度和灌胶注意事项是什么？
8、细胞或组织提取蛋白需要注意事项有哪些？
9、如何避免WB实验中的假阳性或假阴性结果？
10、WB结果如何分析及其注意事项？
11、洗膜的条件优化和注意事项是什么？
12、电泳缓冲液配制和电泳条件优化要点是什么？

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2013-11-11 17:39 浏览 : 16944 回复 : 70

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wh2008 编辑于 2013-11-26 11:54

• 国家卫健委：石家庄2家医院院感防控不力致出现14例关联感染

楼主

wh2008

丁香园中级站友

热

2楼

参考答案：

1、显影为阴性结果的原因有哪些？
1) 二抗条件过低：提高二抗浓度、延长二抗孵育时间或孵育温度；
2) 一抗条件过低：提高一抗浓度、延长一抗孵育时间或孵育温度；
3) 抗原过少：提高上样量；
4) 抗体种属不兼容：一抗species reactivity中是否有需要检测样品的种属来源，一抗与二抗是否相匹配；
5) 酶活性：二抗上标记的HRP或AP等酶活性降低，如抗体过期或反复化冻等；
6) 封闭过度或封闭剂不兼容：降低封闭剂浓度、缩短封闭时间，或者更换封闭剂种类；
7) 底物出现质量问题：可以通过点杂交试验排除底物和酶活性问题；
8) 抗体稀释液pH：注意检测pH是否在6-8；
9）样品不表达该目的蛋白：
10）转膜不足或过头：优化转膜条件；
11）其它：PVDF膜、保鲜膜质量问题等
12）抗体质量：换兴誉好的品牌抗体公司，如CST、Millipore、Abcam等。

2、显影有杂带或背景的原因有哪些？
1）二抗条件过强：降低二抗浓度、缩短二抗孵育时间或改变温度等；
2）一抗条件过强：降低一抗浓度、缩短一抗孵育时间和改变温度等；
3）上样量过高：降低上样量，减少抗原含量；
4）封闭不全：升高封闭剂浓度、延长封闭时间或更换不同的封闭剂i；
5）膜清洗不全：增加清洗强度，如增加荡洗次数、延长清洗时间或加0.05-0.1%Tween 20等；
6）ECL发光液本身因外源污染等原因存在很强的背景光，显影可以显示强的背景光，建议分装A和B液和更换发光液；
7）缩短压片或曝光时间；
8）抗体质量不佳：如特异性不好，建议购买品牌公司的抗体。

3、加发光液光消退的原因有哪些？

4、一抗或二抗的选择要点和抗体孵育要点是什么？
5、封闭液的选用要求是什么？
1）常用封闭液为脱脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、无蛋白封闭液等；
2) 封闭液浓度：封闭时一般用5%脱脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%无蛋白封闭液；配制二抗稀释液一般为1-5%脱脂牛奶，全部用PBS稀释。
3) 封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时。
4) 封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封闭液和稀释抗体的封闭液需要调pH至7.4；但是大多数抗体不调pH也可以做出来。
5) 个人经验：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。

6、膜选择和转膜条件如何优化？
7、胶浓度和灌胶注意事项是什么？
8、细胞或组织提取蛋白需要注意事项有哪些？
9、如何避免WB实验中的假阳性或假阴性结果？
10、WB结果如何分析及其注意事项？
11、洗膜的条件优化和注意事项是什么？

12、电泳缓冲液配制和电泳条件优化要点是什么？

2013-11-11 17:40

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wh2008 编辑于 2013-11-26 22:24

• 医院试工害怕被「白嫖」怎么办？究竟去还是不去？

杨旭章涛

入门站友

3楼

在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象

2013-11-12 08:57

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• 酚酞片严重不良反应被禁用？你了解吗？

jiangliyangamy

常驻站友

4楼

请问加入ECl发光液后没有发光，内参和目的蛋白都没有发光，其中内参的膜虽然没有发光但还是压片了，压了2分钟样子吧，显影定影没有条带；目的蛋白的膜就直接没有压片了，然后回收到TBST buffer中了。经分析，怀疑是二抗可能失效了，原因是时间比较久，曾经冰箱断电比较长时间，二抗在室温下保存了很长时间。然后就想用这几张膜重新再做一次。该怎么个做？
需要洗脱蛋白么？还是说可以直接就上新的二抗孵育？还是要重新孵育一抗，二抗？
根据一个老师建议是不用洗脱蛋白，也不用TBST洗，可以直接把膜重新封闭，一抗，二抗孵育也就是当做是一张刚电转完的膜做一遍？我总觉得有问题，这样做的话，原先的结合的一抗应该还在，二抗如果有问题的话，可能是没有结合上去，也有可能是结合上去了但是过氧化物酶失效，不能在发光液作用下发光，如果是后者的话，岂不是我是在一张已经结合有一抗和二抗的膜上再孵育一次一抗和二抗，那重新孵育的怎么能结合上去呢？

2013-11-12 23:27

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