• 论坛首页
  • 我的丁香客
  • 找人
    查找好友
  • 更多
    丁香园
    丁香通
    丁香人才
    丁香会议
    丁香搜索
    丁香医生
    丁香无线
    丁香导航
    丁当铺
    文献求助
    医药数据库
    丁香诊所
    来问医生
登录 注册

蛋白质和糖学

关注今日：17 | 主题：441636
论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  蛋白表达纯化
  • 发帖
    每发1个新帖
    可以获得0.5个丁当奖励
  • 回帖

分享到：

  • 微信

    微信扫一扫

  • 微博
  • 丁香客
  • 复制网址

【原创】原核表达的心得 [精华]

  • 查看全部
  • 页码直达：
  • 直达末页
楼主 长衣飘飘
长衣飘飘
常驻站友

  • 2
    积分
  • 71
    得票
  • 5
    丁当
  • +2 积分
  • 1楼
这个帖子发布于7年零178天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近2个月都在做原核表达，刚开始什么都不会，连SDS-PAGE都跑成模糊的一片，其中的辛酸只有自己知道，现在实验慢慢上正轨了，自己也积累了一些经验。很怀恋之前探索的那段时光，现在把我做蛋白表达的过程和一些问题写出来，希望能够帮助开始做蛋白表达的人少走一些弯路。

1、表达载体的构建

构建表达载体是比较简单的，不过也是需要对你的蛋白还有所用的载体有一个详细的认识，对于比较大的蛋白最好选用能够助溶的标签，但是也不是固定的，比如我的蛋白有65-70KD，我也用的也是HIS，上清也是有少量表达。最关键的我觉得是ORF框不要发生移码突变，比较保险的做法可以先做电子克隆预测，推荐accelrys gene，功能很强大，非常好用。转化我是分两步走的，连接产物先转化DH5α再提质粒转化BL21，虽然比较繁琐但是比较保险，一般不会出现什么问题。构建载体没有出现什么大问题，所以也没有什么经验跟你们探讨，我从引物合成到测序完成，边做边玩2周搞定。

2、原核表达

原核表达遇到的问题就很多了，最开始跑的图非常差，我都不好意思拿出来，所以说开始实验做得不好没有关系，没有人天生就会，都要靠后天慢慢学习。

现在开始正题，开始，图方便，晚上接菌(接的很少，5μl接到10ml中)，第二天加1mM IPTG 37°诱导3小时，SDS-PAGE图如下：（3#和5#菌是我两个测序正确的单菌落，I是有加IPTG诱导）

实验组和对照组蛋白表达没有差异。
后来拿过夜的菌液去测OD，呵呵，2点多，果断重新接菌，我一般按照1:100（园子的以前的大神说的）取过夜的菌液加到新的LB-KANA培养基，一般摇个3小时，OD=0.8，再去跑SDS-PAGE，图如下：（我的目的蛋白是65KD,红色的marker是70KD）

有诱导和没有诱导蛋白表达差异很明显，信心十足往下做，这一次还是图方便，一般接菌时为了能快点让菌的OD达到0.8，我把转数提高到了220rpm，我比较懒，既然是已经调了220rpm了，诱导的时候也就索性还是220rpm，还是37°3h。这次我还顺便做了IPTG梯度，单位是mM，SDS-PAGE图如下：

结果很郁闷，之前虽然目的蛋白也是很少，但是至少还是和上面的条带差不多大，但是这次，小的可怜（红色箭头标出）0.2mM的IPTG还不足以诱导蛋白表达，但是IPTG的浓度对蛋白表达也没上面影响。

什么原因，什么原因呢，隐约记得上次蛋白量比较多好像是160rpm摇的，马上换转数，SDS-PAGE图如下：

蛋白大小又回到原来大小了，原来转数真的影响表达啊，没有加IPTG的菌体自身蛋白比较多，说明IPTG对菌体还是有影响的，IPTG的浓度真的没有多大关系，这次0.2mM的也诱导出来了。
蛋白怎么表达这么少呢，是不是诱导时间太少，我又做了6h诱导时间，结果目的蛋白没有多大变化，反而菌体蛋白增加了。那低温诱导过夜呢，试试看，我做了2个温度，16和25，均诱导过夜，160rpm，SDS-PAGE如下：


很开心，还是先验证是目的蛋白再往下做，本来想做质谱，偏偏实验室的质谱坏了，刚好在园里看到有我这个目的蛋白的鼠单抗，哈哈，老天对我真好，果断试用，WB图如下：

接下来看看蛋白在上清还是沉淀表达，我是按照分子克隆指南上面的做法，100ml菌液16度和25度（感觉上次16和25差不多，所以还是做2个温度）过夜诱导，加4ml的结合缓冲液后，加溶菌酶到终浓度为1mg/ml，4°摇床20min，加tritonX-100至终浓度为1%，4°摇床20min，5000g离心20min，沉淀和上清分别上样，图如下：

虽然上清只有一点，但是我已经很开心，今天时间比较晚，没有超声，明天超声后再去跑，感觉应该上清的目的蛋白会更多一点。等我图片出来马上跟大家分享哈。
这是超声20min后的图，目的蛋白明显多了，但是杂蛋白也多了，接下来去配过柱子的各种缓冲液了，祝自己好运吧


谢谢大家我支持，今天刚跑完的图片，其中过柱裂解液是菌体裂解后上清过柱后收集的液体，未过柱裂解液是菌体裂解后上清的液体（应该算阳性对照吧这个），看出来250mM处蛋白挺多的，这样应该就没有问题了吧，我这个是50ml菌液摇的，5ml裂解上清，上样为10μl，祝大家实验顺利哈。以后会用lc-ms研究这个蛋白和受体的作用，有什么新的进展我会更新的
版主cake2003留言:
图文并茂，感谢楼主奉献秘籍！
  • 邀请讨论

    • 不知道邀请谁？试试他们

    换一换
2013-08-05 20:12 浏览 : 19677 回复 : 62
  • 投票 54
  • 收藏 335
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
长衣飘飘 编辑于 2013-08-14 11:17
  • • 可以瞒着医院偷偷考研吗？
楼主 长衣飘飘
长衣飘飘
常驻站友

  • 2
    积分
  • 71
    得票
  • 5
    丁当
  • 4楼
viviank
不错哦

谢谢你的肯定哈
2013-08-06 10:37
  • 投票
  • 收藏
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 每天鼻塞流涕，一年四季“感冒”，这是为什么呢
楼主 长衣飘飘
长衣飘飘
常驻站友

  • 2
    积分
  • 71
    得票
  • 5
    丁当
  • 8楼
武厚
问一下，你们过柱之后如何去除蛋白中的咪唑啊？

试过超滤和透析，超滤之后膜上和流穿液都没有检测到蛋白，很奇怪，有人说可能蛋白都吸附在膜上，把孔给堵了，不推荐超滤，透析效果很不错，刚开始有些絮状沉淀，PH调了一下就没有了，蛋白几乎没有损失
2013-08-27 17:14
  • 投票 1
  • 收藏
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 论卫生高级职称下放单位自主评审的利弊
楼主 长衣飘飘
长衣飘飘
常驻站友

  • 2
    积分
  • 71
    得票
  • 5
    丁当
  • 11楼
周灿
你好，根据你的图，你的蛋白是沉淀中比上清中多？请问你纯化用的是上清还是沉淀？

上清，虽然上清蛋白比较少，但是能省去包涵体纯化一系列繁琐的实验，得到的蛋白浓度还可以，130μg/ML
2013-08-30 11:22
  • 投票 2
  • 收藏
  • 打赏
  • 引用
  • 分享

    • 微信扫一扫

    • 新浪微博
    • 丁香客
    • 复制网址
  • 举报
    • 广告宣传推广
    • 政治敏感、违法虚假信息
    • 恶意灌水、重复发帖
    • 违规侵权、站友争执
    • 附件异常、链接失效
    • 其他
  • • 勇于坚持。2021天医，首医，东大，福医考博，已拟录取天医，我的感恩回馈。

关闭提示

需要2个丁当

丁香园旗下网站

  • 丁香园
  • 用药助手
  • 丁香通
  • 文献求助
  • 丁香人才
  • 丁香医生
  • 丁香导航
  • 丁香会议
  • 手机丁香园
  • 医药数据库

关于丁香园

  • 关于我们
  • 丁香园标志
  • 友情链接
  • 联系我们
  • 加盟丁香园
  • 版权声明
  • 资格证书

官方链接

  • 丁香志
  • 丁香园新浪微博
引用回复