发帖
每发1个新帖
可以获得0.5个丁当奖励
回帖

【进展】07242013-Nature-Article-GPCR-B类受体-晶体结构

查看全部
页码直达：
直达末页

楼主

铁杆站友

1楼

这个帖子发布于7年零170天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

07242013-Nature-Article-Structure-GPCR-B-family-comment
本周Nature上有两篇B类GPCR晶体的文章，以及一篇评论。为便于各位更好地了解文章内容，先将评论全文试译如下，随后是两篇文章的全文试译。
评论：
Title: Meet the B family

题目：和GPCR的B类家族成员见一面

Abstract The first crystal structures of class BG-protein-coupled receptors have been solved. They reveal features that mightinform drug-development strategies for diseases ranging from osteoporosis todiabetes.

摘要： G蛋白偶联受体B类首次晶体结构被解析出来。它们揭示出来的特征可能用于治疗从骨质疏松到糖尿病等疾病的药物研制策略。

（正文）
G蛋白偶联受体是细胞表面受体中最大的一族，也是药物研制的主要目标。这些蛋白都具有一个七次跨膜的螺旋结构，并可以被分为A、B、C三类。跨膜区域是将细胞外信号传导到细胞内的回路，对于跨膜区域的高分辨率的结构解析可以为活性及非活性配体如何修饰受体的结构提供说明信息。然而迄今这类研究主要局限于A类受体。本期刊物中，由Hollenstein等及Siu等人分别展示了两个B类受体的跨膜区域的结构：促肾上腺皮质激素释放因子1受体（corticotrophin-releasingfactor-1 receptor）和胰高血糖素受体（glucagon receptor）。

B类GPCRs包括几种多肽激素的受体，它们参与大量生理性功能从骨的维持和葡萄糖的调节到免疫功能和疼痛传递。结果，这些受体成为治疗几种疾病包括骨质疏松和2类糖尿病的现有药物的目标，也是治疗更多的疾病包括从肥胖和偏头痛到抑郁和慢性阻塞性肺病等正在追踪的目标。

Hollenstein与同事展示了一个3.0?分辨率的促肾上腺皮质激素释放因子1受体（CRF1R）与小分子抑制剂形成复合物的结构。他们通过在这个GPCR中引入12个热稳定性突变以及在第二个细胞内环状结构中插入T4溶菌酶蛋白来得到这一结构。Siu与同事使用一种大体上没有修饰过的蛋白版本来得到他们的3.4?分辨率的胰高血糖素受体结构，除了其氨基端被一个热稳定性蛋白进行了替换。B类GPCRs的天然N端对于多肽的结合很重要，但这两个组为了促成蛋白的结晶都将这一区域去除了。

正如预期那样，两个结构的核心都显示7个跨膜的螺旋结构（TM1-TM7）。然而，虽然在蛋白细胞内侧这些螺旋的相对位置与A类GPCRs有所重叠，但在这两类受体的细胞外侧则存在大量的不同。在这两个B类蛋白中，TM6和TM7的定位有所不同，导致TM6从TM5移开，TM1似乎与TM7呈平行。这种排列导致B类蛋白受体核心中形成一个更宽更深的胞外空洞，一般认为它构成了多肽配体结合位点的一部分。此外，在CRF1R和GCGR结构之间存在不同，体现在TM6和TM7的顶端片段（图1）。虽然还不清楚这些差异是否受到结晶过程的影响，但这些差异说明需要其他B类受体跨膜核心结构的解析对于我们理解配体如何结合和激活这些蛋白是必要的。

B类受体对于治疗目的的主要障碍是其尽人皆知的小分子配体确认的棘手性，特别是小分子的激活剂。新产生的结构内容对于解释为什么是这样给出了一些提示：受体结合口袋的开放性使小分子配体很难捕捉到足够的关键性氨基酸残基来启动对受体的激活作用。尽管如此，解析的结构所显示出的特征的小型口袋还可能作为基于结构的药物设计的位点。

Figure 1 | Structuralfeatures of class B GPCRs.
Hollenstein et al.3 and Siu et al.4 present the crystalstructures of two class B G-protein-coupled receptors: CRF₁R(orange ribbons) and GCGR (blue ribbons), respectively.
a, The structures revealthe locations of conserved amino-acid residues that form similar interactionsin the two receptors, including between the transmembrane helices TM2, TM3 and TM4(cyan), TM2 and TM3 (purple), TM1, TM2 and TM7 (beige), and TM2 and TM6 withthe intracellular helix 8 (blue).
b, The view of theproteins from outside the cell highlights the differences between the twostructures at their extracellular faces, particularly in TM6 and TM7.

图1 B类GPCRs的结构特征
a，结构显示出在两个受体中形成相似的相互作用的保守氨基酸残基的位置，包括在跨膜螺旋之间的TM2，TM3和TM4（天蓝色）；TM2和TM3（紫色）；TM1，TM2和TM7（米黄色），TM2和TM6与胞内螺旋8（蓝色）。
b，从胞外视角观察可见两个结构在胞外的不同，特别是TM6和TM7。

有意思的是，Hollenstein与其同事的结构显示小分子抑制剂结合在CRF1R核心胞内部分的一个非常深的口袋中。这个配体与TM3、TM5和TM6的残基之间形成了延伸性的接触，通过将TM6的胞内部分向TM3和TM5的方向拉动而限制了胞内界面上构象重排的活动，这样使受体激活受到可能性的抑制作用。这一结果代表着设计小分子配体的一个新目标。然而，在GCGR结构平衡区域中的氨基酸侧链更紧密，为允许大小相似的配体结合需要进行重排作用。

A类受体中进化保守的氨基酸残基在维持受体处于非活性（或弱活性）状态中起重要作用。虽然B类受体的胞内界面与A类很相似（唯一的例外是TM7的向内变动），但一些维持A类非活性构象的相互作用（包括牵引TM3胞内部分朝向TM6的离子锁作用，TM6中的CWXP基序，TM7中的NPXXY基序）在两个研究的B类受体中都没有出现。

B类受体也有一个特异模式的保守性氨基酸基序，这一基序对于维持非活性构象或为激活作用的构象变化是非常重要的。CRF1R和GCGR结构表明在这些关键性残基的一部分之间存在着保守性的相互作用（图1）。此外，A类和B类的结构中都存在着如TM1和TM2、TM1和TM7、TM3和TM4、TM3和TM6之间相似的区域接触，虽然这些相互作用是通过各自类型不同的残基模式进行调节的。这样，新的结构内容告诉我们两类受体蛋白是使用不同的机制进行构象变化控制的。

虽然这些新的报道通过晶体结构的解析展示了在GPCR生物学领域中极大的突破，但B类受体的质膜中的结构仅仅提供了受体的一个初步印象，实际上（从半胱氨酸陷阱研究结果中）我们已经知道这些受体是高度动态的蛋白。有关受体上N端区域以及跨膜螺旋最终的取向等重要的问题仍有待解决，还有天然的激活剂分子如何与这两个区域进行结合从而激活受体这一问题也仍待解决。要回答这些问题则需要完整的配体-受体-G蛋白复合物的晶体结构的解析以及受体动力学的研究结果。（全文完）

文章一

Title：Structure of class B GPCR corticotrophin releasingfactor receptor 1

题目：B类GPCR促肾上腺皮质激素释放因子受体1的结构

Abstract Structural analysis of class BG-protein-coupled receptors (GPCRs), cell-surface proteins that respond topeptide hormones, has been restricted to the amino-terminal extracellulardomain, thus providing little understanding of the membrane-spanning signaltransduction domain. The corticotrophin-releasing factor receptor type 1 is aclass B receptor which mediates the response to stress and has been considereda drug target for depression and anxiety. Here we report the crystal structureof the transmembrane domain of the human corticotrophin-releasing factorreceptor type 1 in complex with the small-molecule antagonist CP-376395. Thestructure provides detailed insight into the architecture of class B receptors.Atomic details of the interactions of the receptor with the non-peptide ligandthat binds deep within the receptor are described. This structure provides amodel for all class B GPCRs and may aid in the design of new small-moleculedrugs for diseases of brain and metabolism.

摘要 B类G蛋白偶联受体是细胞表面蛋白，它负责对多肽激素的应答，对这些蛋白的结构分析受到其氨基端胞外结构域的限制，因此我们对于垮膜信号传导结构域的理解认识不多。促肾上腺皮质激素释放因子I类受体是一种B类受体，它具有对应激的调节作用，已被认为是治疗抑郁和急躁的药物目标。在此我们报道人促肾上腺皮质激素释放因子I类受体的跨膜区与小分子拮抗剂CP-376395形成的复合物的晶体结构。这一结构为B类受体的结构特征提供了详细的内容。我们对于受体与结合在受体深处非多肽类配体之间相互作用在原子水平上的细节进行了描述。这一结构为所有B类GPCRs提供了一个模型，可能对于治疗脑和代谢类疾病的新的小分子药物的设计有所帮助。

（正文）
介绍
G蛋白偶联受体（GPCRs）从激素、神经递质以及代谢物那里将细胞外信息传递通过质膜，按照其序列的相似性可分为四个主要家族：A类（视紫红质类）、B类（分泌素，secretin）、C类（促代谢性谷氨酸，metabotropic glutamate）、和蜷曲类（frizzled）。B类是第二大家族，又被细分为分泌素亚家族及粘附亚家族。分泌素亚家族由15个GPCRs组成，包括一些针对多肽类配体的受体，这些多肽类配体如分泌素（secretin）、胰高血糖素（glucagon）、类胰高血糖多肽（GLP，glucagon-likepeptide）、降血钙素（calcitonin）基因相关多肽、甲状旁腺素（PTH，parathyroidhormone）和促肾上腺皮质激素释放因子。这些多肽类配体是治疗那些危害严重的疾病的药物目标，这些疾病包括糖尿病、骨质疏松（osteoporosis）、偏头痛（migraine）、抑郁（depresssion）和焦虑（anxiety）。许多B类的GPCRs已由其天然配体衍生的可注射多肽药物通过了临床上的认证，这些药物包括艾塞那肽（exenatide），一种治疗糖尿病的类胰高血糖素多肽1（GLP-1）受体拮抗剂，还有特立帕肽（teriparatide）是一种治疗骨质疏松的甲状旁腺激素1受体激动剂。然而，已经证实对于这些受体来说发现小分子调解物极为困难。

从2000年以来，超过18个A类受体和一个蜷曲类受体的结构已经得到解析，这极大地增长了我们对于GPCRs的功能在分子水平上的理解。此外，与小分子形成的复合物的高分辨率结构的解析使得基于结构的药物设计技术首次在GPCRs中得到应用。与A类受体相反，B类受体的结构信息受到其氨基端胞外结构域（ECD，extracellular domain）的限制，迄今还没有一个B类的跨膜结构域-小分子药物的主要目标-被解析出来。

促肾上腺皮质激素释放因子（CRF，corticotropin releasing factor）是一个41个氨基酸的多肽类激素，也是应激反应（stressresponse）的关键调解物。通过对下丘脑-垂体轴的激活以及自身作为一种神经递质，CRF对很大范围内的生理性应答具有影响作用，这些生理性应答包括食欲的控制、心血管调解作葡萄糖代谢活免疫功能和行为等。CRF和相关的尿皮素（urocortin）多肽（Ucn1-3，亦称为UCN，UCN2和UCN3）通过两类哺乳动物受体CRF1和CRF2来调解它们的作用。CRF1受体（亦称CRHR1）是由CRF和Ucn1激活的，一般在脑组织中表达，包括垂体、下丘脑、扁桃体和大脑皮层中。CRF1R拮抗剂对于许多由压力产生的征兆如焦虑、抑郁以及肠易激综合症（irritable bowel syndrome）具有治疗的可能性已经得到评估。迄今受体的胞外部分与CRF形成的复合物结构有许多已经得到解析。如同在其它B类GPCRs中一样，天然多肽激动剂的羧基端主要结合在受体的ECD上，而一般认为其氨基端部分与TMD结合并对其具有一定的约束作用，这导致受体的激活。相反，小分子拮抗剂如CD-376395-由高通量筛选发现-通过别构作用与TMD结合来抑制多肽类激动剂的结合及信号传导作用。为增加我们对于B类GPCRs作用模式的理解并使这一类重要的受体基于结构的药物设计得以实现，我们对人的CRF1R的TMD晶体结构进行了解析。

结构测定
为获得CRF1R跨膜区域的结构，我们使用以前介绍过的方法研制了一种偏向处于非活性构象的热稳定性受体（StaR）.StaR中含有12个置换氨基酸，它们都不处于拮抗剂结合位点上或其附近。形成结晶的构造物没有ECD，我们将T4溶菌酶（T4L）插入到其胞内环状结构（ICL，intracellular loop）2中（图1）。为增加表达水平，羧基端中预测性螺旋8结构被除去而使羧基端被截短。这一构造物对2-芳氧基-4-烷基氨基吡啶CP-376395的亲和性与野生型CRF1R相似（补充表1）。这一构造物的结构通过分子置换在每个非对称单元中含三个受体分子（A-C）的情况下以3.0?的分辨率被解析出来（补充图1-4）。文章接下来的部分将讨论分子C，它在氨基酸117-367部分具有连续性密度。

Figure 1 | Schematic representationof the CRF1R structure. Forcrystallization, both termini of humanCRF1R were truncated resulting inconstructs of theTMD(residues 104–373) lacking the ECD involvedin peptidebinding.Thermostabilizing mutations and residues involved in small-moleculeantagonist binding are highlighted in greenand blue, respectively. Othermodifiedsequence is coloured in grey. The disulphide bond between Cys 258in ECL2 and Cys 188 at the top of TM3 isindicated by a yellow line. Thesites of the T4L insertions into ICL2 areindicated (see Methods for details onconstructs CRF1R 76 and CRF1R 105). Thefirst and last residues of each TMhelix are labelled (Wootten numbering insuperscript26).

图1 CRF1R结构示意图
为进行结晶，我们对人CRF1R的两端进行了截短，得到的构造物中TMD（残基104-373）部分没有参与多肽结合的ECD。热稳定性突变残基和参与小分子拮抗剂结合的残基分别以绿色和蓝色示出。其它修饰过的序列用灰色标示。ECL2上Cys258与TM3顶端的Cys188之间的二硫键用黄线示出。ICL2上T4L的插入位点如图示。每个TM螺旋的第一个和最后一个残基以Wootten编号在上角标注明。

整体结构
受体的核心折叠部分即七个跨膜螺旋（TM1-TM7）与那些已被解析过的GPCR结构中见到的排列方式基本一致（图2）。远离胞外环状结构（ECL）1的连接性环状结构没有二级结构，而胞外环状结构ECL1中有一个短α-螺旋与膜呈平行位置。在对于PTH1受体的NMR研究结果中曾假设ECL1上具有一个螺旋结构，或许这是B类GPCRs的一个保守性结构特点。ECL2通过Cys188和Cys258之间的二硫键与TM3结合，这两个半胱氨酸在B类受体中是完全保守的。这种在大多数A类GPCRs中也存在的二硫键曾被报道在B类GPCR的GLP-1受体中对于激动剂诱导的受体激活作用是重要的。

Figure 2 | Overall structure.
a, b, Ribbon representation of CRF1R in rainbowcolouration (amino terminus, blue; carboxyterminus, red) viewed from themembrane from two angles. The antagonistCP-376395 is depicted in space fillrepresentation with carbon, nitrogen andoxygen atoms coloured magenta, blueand red, respectively. The disulphide bondlinking ECL1 and TM3 is shown asyellowsticks. Thethermostabilizingmutations are rendered as green sticks. Theposition of the T4L insertion is indicated.
c, The receptor is viewed from theextracellular side.
d,Same view as in c,but in a surface representation colouredby electrostatic potential.

图2 整体结构
a，b，从膜方向两个角度看使用彩虹着色法（氨基端蓝色，羧基端红色）的CRF1R带状结构示意图。分别用紫红色、蓝色和红色来显示拮抗剂CP-376395上的碳、氮和氧原子。连接ECL1和TM3的二硫键用黄色棒状示出。热稳定性突变以绿色棒状示出。T4L的插入位置如图所示。
c，从胞外方向对受体的视图。
d，与c为同一方向，但通过颜色显示其表面静电电位分布情况。

与A类GPCRs的比较
将CRF1R的结构与已经解析的GPCRs相比较将会为我们提供A类和B类受体不同结构特性的内容。与A类GPCRs不同，CRF1R的TMD呈现一个非常明显的V字形（图2b），在朝向胞外一侧形成一个很大的空洞，我们推测这将是多肽的结合位点（图2d）。我们使用多巴胺D3受体（D3R）作为A类GPCRs的代表来详细描述结构上的差异，因为D3R的整体结构与CRF1R最接近（补充表2）。将这两个受体叠加在一起后我们发现TM7排列上的惊人差异，还有TM6上很多细小部分的差异（图3，补充表2）。在这两个受体中，我们预想TM7是相似的急转性的结构。然而在CRF1R上，其胞外末端距螺旋束轴的距离比D3R远大约10?，结果TM7相对于D3RGly356附近的轴向产生一个约25°的旋转（补充图5，补充表3）。由于CRF1R羧基端螺旋8被除去而截短，因此这可能影响到在结晶中所见的TM7的位置，然而这种截短并没有影响到受体的配体结合性质（补充表1）。在CRF1R中的TM6也与TM5还有螺旋束拉开了一定的距离。此外，CRF1R的胞外末端要比D3R短两个螺旋圈，这会对TM5和TM6与其胞内区域的相互作用起到一定的限制。

TM1略微弯曲的胞外部分包裹着TM7，这样形成相似的远离受体中心的抛物线形。高度保守的Ser130通过与骨架结构上Phe357和Ser353形成的氢键作用对TM7的急转式结构具有稳定作用（图4a，补充图6）。类似的相互作用在A类受体中可以见到，一个1.50（Ballesteros-Weinstein编号法）位置的天冬酰胺，与CRF1R上位于一个螺旋上的Ser130相当，与TM7的骨架相结合。而在大多数A类受体中TM2的胞外尖端部分向TM1倾斜，在CRF1R中的TM2则更直一些，对于受体的开放性质有作用。由于此处解析的结构没有ECD，因此这一结构没有提供ECD与TMD相对位置的内容，也不能提供配体结合后受体激活的机制。我们假定B类受体的激活通过一个两步的进程。首先受体ECD的氨基端与多肽配体的羧基端结合，这导致受体结构发生重排，多肽激动剂的氨基端插入到跨膜螺旋束中，激发TMD的构象转变为活性G蛋白结合状态。在结构中见到的TMD开放的结构也许与ECD形成复合物中的大型多肽激动剂与TMD的相互作用相关。

A类和B类GPCRs通过同样的效应蛋白实施信号传导，这些效应蛋白与受体的胞内部分进行相互作用。CRF1R与D3R的比较说明，与其胞外部分不同，它们的胞内部分叠加的很好（图3d，补充表3）。特别是TM3和TM5的胞内一半，有报道发现在β2-肾上腺素受体-Gs复合物中，它们与Gαs具有相互作用，在CRF1R和D3R中形成相似的构象。虽然由于T4L的插入而缺失天然的ICL2，TM4胞内部分相对于TM3的排列与D3R中的情形相似。这将会把ICL2引入到与A类受体相似的位置，使得受体完成与G蛋白的相互作用。虽然CRF1R中的TM6向外倾斜，其胞内末端朝向TM3的方式与D3R还有以非活性状态解析的A类受体相似（补充图7），说明我们研究的CRF1R的构象也代表非活性状态。

Figure 3 | Comparisonof the antagonist-bound structures of CRF1R andD3R.
a–e, The superimposed structuresof CRF1R andD3R (PDB ID 3PBL) areshown as blue and yellow ribbons,respectively. The receptors are viewed fromtwo different angles from within themembrane (a,b),from the extracellularside(c),and intracellular side (d).Arrows in c highlightlarge differences in thehelicaltrajectories of the two receptors. e, IndividualTMhelices are shown aftersuperposition of the two receptors as in a–d. The superposition of D3RontoCRF1Rwas done as described in Methods.

图3 CRF1R和D3R的拮抗剂结合结构的比较
a-e，CRF1R与D3R（PDBID：3PBL）的叠加，CRF1R为蓝色，D3R为黄色。a和b组图为从膜内两个不同角度的视图。c为从细胞外侧，d为从细胞内侧的视图。C图中的箭头强调了两个受体上螺旋性轨迹的较大差异。e为各个TM螺旋分别叠加比较。

保守性基序的相互作用
在A类的GPCRs中，在非活性构象中一个保守性盐桥将TM6与TM3连接起来。B类受体缺乏这种离子锁的基序序列。生化数据说明在激活过程中His155与Glu209之间具有相互作用。在CRF1R中这些侧链处在氢键的距离之内，形成一个可能的重要产能相互作用（图4b，补充图6）。在B类GPCRs中，在TM4中存在一个保守的基序序列GWGxP。结构显示这一基序Trp236周围存在一个网络性相互作用（图4c，补充图6）。TM4的构象在Gly235处放松，导致Trp236向TM2和TM3方向伸出。这个侧链与Asn157形成氢键，与Trp205形成一种由边到面的相互作用。TM4-TM3的相互作用通过Tyr197与Trp236的氢键作用以及Gly235与Trp205、Pro239与Tyr197的疏水作用得到加强。这些保守的相互作用似乎起到了重要的结构性作用。从结构中还不能立即清楚它们是否参与了受体的功能作用。

Figure4 | Conserved sequence motifs. a–c, CRF1R is shown in blueribbonswithinteracting residues shown as sticks with carbon, nitrogen and oxygenatoms coloured grey, blue and red,respectively. Interacting residues and TMhelices are labelled. Hydrogen bonds aredepicted as red dotted lines and theirlengths inA? are indicated.CP-376395 is representedin sticks and coloured as inFig.2a.

图4 保守性序列基序
a-c，CRF1R以蓝色带状结构表示，参与相互作用的残基上的碳、氮、氧分别以灰色、蓝色和红色表示。参与相互作用的残基和TM螺旋在图中标注出。氢键以红色虚线标出，长度亦在图中标示出。

小分子拮抗剂结合位点
在受体胞内部分一个口袋装结构中不曾预料地发现CP-376395的强电子密度现象（图5）。这个位置令人惊奇，因为它距朝向胞外侧的大空洞的中心有18?远，而这个空洞是我们预测的多态激动剂的结合位点，另外它还距A类GPCRs结构中小分子配体中心约13-23 ?远（图5d）。在与膜平面呈垂直的方向上，CP-376395结合在由TM3、TM5和TM6为主形成的疏水性口袋中。高度保守的Asn283侧链与吡啶上的氮形成必需的氢键，因此将Asn283替换为Ala则会完全失去配体结合能力（补充表4）。芳香性部分与由Phe284、Leu287、Ile290、Tyr316、Leu319和Leu320形成的疏水性口袋结合。环外的烷基氨基部分与Gly324以及Phe203、Leu280、Leu323和Tyr327的侧链相互作用。为证实这些相互作用，我们将拮抗剂结合位点的氨基酸用丙氨酸替换（补充表4）。除了Leu319，其他突变的结果导致拮抗剂的结合显著下降，其中Phe203Ala、Leu280Ala和Asn283Ala的结合完全丧失。

在推测的受体内源性配体结合位点底部，Arg165、His199、Met276和Gln355的侧链在拮抗剂结合位点的上方形成了一个侧链层（图5e）。曾有报道指出His199和Met276的突变会削弱非多肽类拮抗剂对CRF1R的结合。虽然并没有直接与CP-376395相互作用，但His199与Tyr327之间形成的氢键和Met276对Phe203的包埋作用，可能对这两个芳香性残基的定位具有支持作用。使用Ala对高度保守的Gln335的置换并没有影响到CP-376395的结合作用（补充表4）。然而，突变形成的研究结果说明这个残基可能对受体的激活作用具有产能方面的贡献。

在CRF1R与CRF2R之间的螺旋束上的序列相同性非常高；但非多态类拮抗剂CP-376385却对CRF1R具有高度的选择性。两个受体之间所有与配体直接结合的残基都是保守的。在小分子周围（5?之内）的第二层氨基酸在CRF1R与CRF2R之间只有两个残基不同。CRF1R上的His199和Met276对应CRF2R上的Val195和Ile272。在CRF1R中将这些残基突变为CRF2R相对应的残基会减少非多肽类拮抗剂的结合亲和性，但不影响多态类配体的结合。虽然这些残基可能对配体的结合具有非直接的影响，但它们也可能通过影响相邻的Phe203的侧链取向来控制向小分子拮抗剂结合位点的进入，Phe203与CP-376385具有直接相互作用。

在β-肾上腺素受体中，TM6的胞内部分显示通过移出TM集束的中心而在受体激活上具有关键作用。CP-376395与TM3、TM5和TM6都有广泛的接触。特别是它与TM6急转结构的两侧都有结合作用，这个急转结构是由Pro321和Gly324诱导形成的。曾有人假设CRF1R的小分子拮抗剂通过将受体维持在非活性构象而起别构性作用。CP-376395在结构中的位置说明这确实是与内源性配体多态结合区域不同的别构性位点。有可能CP-376395通过对TM6胞内部分对TM3和TM5胞内部分的约束作用来保持受体处于非活性构象。这一假设得到支持的事实是CP-376395以反激动剂形式作用而减少基态的信号传导作用（补充图8）。

从细胞外侧进入到拮抗剂的结合位点被Phe203和Tyr327的侧链限制为一个很小的通道（图5f）。如果CP-376395要从细胞外进到拮抗剂结合位点的话，可能需要通过测链旋转异构体的变化或TM3、TM5或TM6的部分变动而对结合位点顶部的残基进行重排，这些变动将使推测的内源性配体结合位点的开口扩大。或者，与膜仅有一层侧链之隔的拮抗剂结合位点，可以通过TM5和TM6将两侧开得更大，使来自膜内的疏水性配体得到扩散。

Figure 5 | Antagonist-binding site.
a, CP-376395 shown as skeletalformula and as sticks coloured as in Fig.2a. Fo2Fc OMIT density calculatedbefore CP-376395 was first included in themodel displayed within 2A? ,contouredat 2.5s.b,View from the membrane with 2Fo2Fc density within2A? of the binding site residues, contouredat 1.5s.OMIT density for CP-376395 as in a.The hydrogen bond to the pyridine nitrogen of CP-376395 is

depicted as a red dotted lineand its length inA?is indicated.

c, Schematic of thebinding site with hydrogen bonds andhydrophobic interactions as red andgreen dotted lines, respectively.
d, The location of CP-376395 is compared tothat of selected class Areceptor ligands.
e, View fromthe extracellular side ontothe bottom of the putative orthostericsite.
f,Cross-section of the solventaccessiblesurface.

图5 拮抗剂结合位点
a，CP-376395以键线式表示，棒状结构颜色如图2a。在CP-376395结合前的Fo-FcOMIT密度首次包括在2?范围内的模型中，2.5σ波状轮廓。
b，2Fo-Fc密度，距结合位点2?范围内，1.5σ波状轮廓，从膜方向的视图。CPJ-376395的OMIT密度与a相同。CP-376395上与吡啶氮形成的氢键用红色虚线表示，其长度如图所注。
c，带有氢键和疏水作用的结合位点草图，氢键和疏水作用分别以红虚线和绿虚线表示。
d，CP-376395与选定的A类受体的配体的位置比较。
e，从胞外一侧向推测为内源性配体结合位点底部方向的视图。
f，溶剂可进入表面的切面视图。

结论
CRF1受体TMD的结构为B类GPCRs提供了结构性框架，可以为相关受体的同源性建模提供一个精确的模板。这一结构还揭示出一个未曾预料的拮抗剂结合位点，为基于结构的小分子药物发现开辟了新的途径。为进一步加深我们对于B类GPCRs作用模式的理解，全长且有激动剂结合状态的受体结构亟待解决。（全文完）

文章二

Title：Structure of the human glucagon class B G-protein-coupledreceptor

题目：B类GPCR胰高血糖素受体的结构

Abstract Binding of the glucagon peptide to theglucagon receptor (GCGR) triggers the release of glucose from the liver duringfasting; thus GCGR plays an important role in glucose homeostasis. Here wereport the crystal structure of the seven transmembrane helical domain of humanGCGR at 3.4? resolution, complemented by extensive site-specific mutagenesis,and a hybrid model of glucagon bound to GCGR to understanding the molecularrecognition of the receptor for its native ligand. Beyond the shared seventransmembrane fold, the GCGR transmembrane domain deviates from class AG-protein-coupled receptors with a large ligand-binding pocket and the firsttransmembrane helix having a ‘stalk’ region that extends three alpha-helicalturns above the plane of the membrane. The stalk positions the extracellulardomain (~12kilodaltons) relative to the membrane to form the glucagon-bindingsite that captures the peptide and facilitates the insertion of glucagon’samino terminus into the seven transmembrane domain.

摘要胰高血糖多肽与胰高血糖受体（GCGR）的结合在节食期间会激发葡萄糖从肝脏中释放出来，因此GCGR在维持体内葡萄糖稳定方面起着重要的作用。在此我们报道有7个跨膜结构域的人GCGR晶体结构基于3.4?分辨率的解析内容，同时辅以定点突变的研究结果，以及一个混合型的胰高血糖与GCGR结合的模型来理解受体与其原有配体的分子识别机制。除了与A类GPCRs同样具有7个跨膜结构域外，GCGR的跨膜结构与A类GPCRs的不同之处在于GCGR的跨膜区具有一个较大的配体结合口袋，而且其第一个跨膜螺旋有一个茎梗区域在质膜上方延伸三个α-螺旋转角。这个茎梗区域将胞外结构部分（12kD）定位在离质膜较近的位置从而形成胰高血糖素结合位点，在这一位点上受体将捕获多肽配体并协助将胰高血糖素的氨基端插入到受体的跨膜区域中。

介绍在人体中，胰高血糖素受体（GCGR）是G蛋白偶联受体（GPCRs）中类分泌素（B类）家族15个成员之一。GCGR是由一个29个氨基酸组成的激素类多肽胰高血糖素激活的（补充图1a），GCGR是治疗II型糖尿病的可能性药物目标。在节食阶段，胰腺分泌胰高血糖素来激活肝脏中的GCGR从而将葡萄糖释放到血液中。虽然A类GPCRs与B类GPCRs只有15%的蛋白序列同源性，我们还是推测这些受体的多数具有一个共同的7次跨膜（7TM）螺旋结构以及相似的信号传导机制。尽管在过去的几年中对A类GPCRs的结构与功能的理解已经大大增强了，但B类GPCRs由于缺乏7TM的结构内容而使我们对它们的详细理解发展缓慢。

分泌素类GPCRs包含一个球状的内含三个保守性二硫键的N端胞外区域（ECD）和一个7TM区域。这类GPCRs的激活是通过激素类多肽与ECD和7TM的结合实现的。几种B类受体的可溶性ECDs，包括GCGR的ECD，以及它们在选择性识别多肽激素羧基端的作用已经被报道过。虽然基于定点突变、光交联以及结构类虚拟筛选研究结果的B类7TM与配体的结合模型已经建立，但由于A类与B类GPCRs之间低序列同源性而使这样的建模研究的准确度受到阻碍。

GCGR的7TM结构域的晶体结构
人GCGR的7TM结构域与热稳定性的大肠杆菌细胞色素前体b562RIL（后称BRIL）在残基123位置相融合，而GCGR的C端被截短到残基432（补充图2）。这一含有一个截短ECD（ΔECD）以及一个截短C端（ΔC）的GCGR与BRIL融合的可结晶的构建体（BRIL-GCGR(ΔECD/ ΔC)，补充图3）具有与全长野生型GCGR（补充表1）同样的与拮抗剂NNC0640的结合亲和性（补充图1b），说明BRIL-GCGR(ΔECD/ ΔC)的7TM结构域的构象与野生型GCGR相似。BRIL-GCGR(ΔECD/ ΔC)的晶体结构在分辨率为3.4?的条件下被解析。虽然GCGR是在NNC0640存在的条件下结晶的，但我们没有发现晶体结构内容中令人信服的NNC0640的电子密度。如预期那样，GCGR呈现一个7TM折叠（图1），BRIL融合蛋白在受体上方形成折叠并调节大多数晶体的接触作用（补充图4）。

虽然缺乏蛋白序列的保守性，将GCGR的7TM与15个已知的并且在非活性形式下得到解析的A类GPCR结构进行比较发现7TM集束的方向和位置在两类受体中是保守的（图1b，补充图5）。GCGR的7TM螺旋与A类受体的7TM的Cα骨架原子均方差根在2.7-3.3?范围内进行叠加，这一范围高于A类GPCRs的主要分支（α、β、γ和δ）之间的2.2-3.0?。GCGR与视紫红质结构排列比较显示两类GPCRs的7TM螺旋残基之间具有一定的空间一致性，但也显示出反映跨膜螺旋中大量结构差异的跨膜区中很多排列对比产生的空隙（补充图6）。7TM残基之间的空间一致性使得我们可以在比较不同类GPCR时应用广泛使用的A类Ballesteros-Weinstein编码体系（本文今后对A类在圆括号中标注BW编码）（补充表3）。然而，在B类GPCRs中进行序列和结构性质分析则基于B类残基的保守性使用Wootten编码体系（本文今后对B类使用上角标注明，补充表3）。

Figure 1 | Structure of the 7TM domain of human GCGR andcomparisontoclass A GPCR structures.
a, Cartoon depiction of the 7TM domainstructure of GCGR. The two views arerotated 180u relativeto each other. Thedisulphidebond between helix III and extracellular loop 2 (ECL2) is shown asyellow sticks.
b,Side view of structural superimposition of 7TM domains ofGCGR (blue) and class A GPCRs (grey).Structures of class A GPCRs used(PDB): 1U19, 2RH1, 2YCW, 3RZE, 3PBL, 3UON,4DAJ, 3EML, 3V2W,3ODU,4DJH, 4EA3, 4DKL, 4EJ4 and 3VW7. Extracellular (EC) andintracellular (IC) membrane boundaries(predicted by OMP server44) areshown as brown and cyan ovals (a) or dotted lines (b), respectively.

图1 人GCGR与A类GPCR结构的7TM区域比较
a，GCGR的7TM区域结构草图。两个视图之间翻转180°。螺旋III与ECL2之间的二硫键示以黄色棒状。
b，GCGR（蓝色）和A类GPCRs（灰色）的7TM区域叠加的侧视图。A类GPCRs使用的结构有（PDB中的ID）：1U19，2RH1，2YCW，3RZE，3PBL，3UON，4DAJ，3EML，3V2W，3ODU，4DJH，4EA3，4DKL，4EJ4h3VW7。胞外区域（EC）和胞内区域（IC）膜的边界分别示以褐色和天蓝色。

GPCRs的A类和B类比较
GCGR的结构显示出7TM区域中存在大量与A类GPCRs的不同之处。GCGR的N端螺旋I要比任何已知结构的A类GPCRs长，并且在胞外质膜边界上方延伸三个额外的螺旋转角（约为16?），从残基Lys136到Gly125（图1）。GCGR这部分被称为茎梗部分，它可能参与胰高血糖的结合并协助限制ECD朝向7TM区域的方向。GCGR的胞外环状结构1（ECL1）有16个残基，而大多数A类GPCRs则为4-6个残基。虽然晶体结构中并没有解析ECL1残基201-215，在我们和其他组的突变研究结果表明这些残基参与了与多肽配体之间的相互作用。7TM螺旋II的EC尖端与螺旋VI之间的距离是GPCR结构中最大的，螺旋III的EC尖端与螺旋VII之间的距离也是除了κ-OR和μ-OR鸦片类受体之外最大的（补充图5）。这7个TM螺旋的EC尖端的定位在GCGR配体结合口袋中产生了一个更宽更深的空洞，它比任何A类受体结构中的都大（图2，补充表4）。

Figure2 | Comparison of the ligand-binding pocket of GCGR with class AGPCRs. Thebinding cavity of GCGR is compared with the binding cavitiesof human chemokine receptor CXCR4 (PDB: 3ODU),human k-opioidreceptor (k-OR) (PDB: 4DJH), rat neurotensin receptor(NTSR1) (PDB:4GRV),human b2-adrenergicreceptor (b2AR)(PDB: 2RH1) and bovinerhodopsin(Rho) (PDB: 1U19) (Supplementary Table 4). The approximateposition of the EC membrane boundary isshown as a red line and boundligandsas magenta carbon atoms.

图2 GCGR与A类GPCRs配体结合口袋的比较。
GCGR的结合空洞与其他A类受体比较，包括：CXCR4（PDB：3ODU），κ-opioid receptor（PDB：4DJH），大鼠NTSR1（PDB：4GRV），β2-肾上腺素受体（PDB：2RH1）和牛视紫红质（1U19）。胞外侧膜边界大致位置用红线表示，结合的配体以紫色碳原子示出。

在细胞内侧（IC），GCGR螺旋末端之间的距离和A类结构处于同一范围，例外的是螺旋VII胞内末端有很多内部改变（补充图5）。虽然在A类受体中螺旋VII胞内部分内部改变是受体激活的特征，但还不清楚GCGR中螺旋VII上IC区域的作用。受体在螺旋VII上没有脯氨酸形成的急转结构，这类结构是A类GPCRs中保守性NP（BW7.50）xxY基序的一部分；但在GCGR中螺旋VII上有的是甘氨酸残基（Gly393^7.50），它允许螺旋在这一区域形成弯曲。GCGR螺旋VII上的这个甘氨酸是FQG^7.50xxVxxxY^7.57CF基序的一部分，而这基序在分泌素类的B类受体中完全保守（图3a）。这个Gly393^7.50诱发的弯曲通过与GCGR螺旋II上Phe184^2.57的疏水相互作用而得到稳定（图3a）。

GCGR结构中还包含一个受体C端有20个残基的胞内螺旋VIII，与对应的A类受体相比这一螺旋向质膜外倾斜约25°（图1）。这种倾斜也许是由晶体包装相互作用产生的（补充图4），但需要注意的是螺旋VIII上的Glu406在分泌素型B类受体中完全保守，而且与保守性残基Arg173^2.46和Arg346^6.37形成两个螺旋间盐桥（图3b）。虽然螺旋VIII的倾斜可能会改变区域内的相互作用，但使用平行于质膜的螺旋VIII进行构象建模的结果说明在这种构象中Glu406的盐桥作用被保留，而且似乎成为分泌素型B类受体的结构特征，因为A类对应的残基中没有如此强的保守性。

GCGR的7TM结构还揭示出了在A类和B类受体之间呈保守性的几个结构特征。其中一个是ECL2上Cys294与Cys224^3.29（BW3.25，补充图6）之间的二硫键，这个二硫键明显对于受体的7TM折叠起稳定作用（图3c）。另一个保守的特征是相似区域之间的接触，包括A类和B类GPCRs中的螺旋I-II、I-VII、III-IV和III-VI之间。然而，两类GPCRs在这些位置上的保守性残基具有不同的模式（图3，补充图6）。在B类GPCRs中，螺旋I-II之间的相互作用通过保守性疏水残基Leu156^1.54和Phe184^2.57得到稳定，而A类GPCRs中在这一区域的是保守性极性残基Asn（BW1.50）和Asp（BW2.50）。在螺旋I-VII之间的界面上，Ser152^1.50与骨架上的Ser390^7.47之间形成氢键（图3a）。将同源性类胰高血糖多肽1受体（GLP1R）上残基Ser155^1.50和Ser392^7.47进行突变会改变受体的信号传导作用。在GCGR螺旋III-IV之间的界面（图3d），保守性残基Trp272^4.50与Trp241^3.46之间具有相互作用，而A类结构中螺旋IV（BW4.50）的Trp残基与螺旋III上位于BW3.38的残基（与GCGR残基Ala237^3.42同源）具有相互作用。在分泌素型B类受体GPCRs的螺旋III-VI之间的界面（图3e）含有保守性疏水残基Tyr239^3.44（或Phe^3.44）与Leu358^6.49（或Phe^6.49）它们可以形成疏水性相互作用，这种作用与大多数A类GPCRs中结构上对应的Ile/Val/Leu（BW3.40）和Phe（BW6.44）之间形成的疏水性作用很相似（补充图6）。在B类GPCRs中这一界面还通过保守性Tyr239^3.44与Gly359^6.50之间的密切接触得到进一步的稳定。在B类GPCR中另一个特异性的螺旋间氢键的形成是在保守性Asn318^5.50和螺旋III-V界面骨架上的Leu242^3.47之间进行的。

Figure 3 | Structural features ofclass B GPCRs. ComparisonofGCGRand class A GPCR crystalstructuresindicates distinct andconservedfeatures.
a, d, e, Thehomologous GCGR residuesinvolved in helix I–II, III–IV, andIII–VI interface interactions asdiscussed for class A receptors byVenkatakrishnan et al.25,and class BGPCRspecific residues that mediatehelix I–VII, II–VII, and III–Vinterface interactions.
b, GCGRresidues Glu 406 of helix VIII,Arg 1732.46, and Arg 3466.37 form aclass B receptor specific ionicnetwork. Arg 3466.37 (grey) has aweak electron density.
c,Thedisulphidebond between Cys 2243.29andCys 294 of ECL2 in the GCGRstructureis a conserved featurebetweenclasses A and B receptors.Hydrogenbond interactions and saltbridgesare indicated by black dashedlines.Electron density maps forresiduesin this figure are shown inSupplementaryFig. 10. Comparisonofclass A Ballesteros–Weinstein andclass BWootten residue numbering isprovided in Supplementary Table 3.

图3 B类GPCRs的结构特征。GCGR与A类GPCR晶体结构的比较说明保守性及特征性。
a，d，e，在螺旋I-II、III-IV以及III-VI之间界面相互作用的与A类比较的同源性GCGR残基以及调节螺旋I-VII、II-VII和III-V界面相互作用的B类GPCR的特异性残基。
b，GCGR螺旋VIII上Glu406与Arg173^2.46和Arg346^6.37之间形成B类受体特异性离子网络作用。Arg346^6.37（灰色）具有弱电子密度。
c，GCGR结构中Cys2243.29与ECL2上Cys294形成的二硫键在A类和B类受体之间是一个保守性结构特征。
氢键和盐桥示以黑色虚线。本图中的电子密度图谱可参考补充图10。A类BW编码体系与B类BW编码体系的比较可参考补充表3。

GCGR和胰高血糖素之间的识别作用
为了更好地理解GCGR与胰高血糖的相互作用，我们对GCGR上90个不同的残基位点进行了大范围的突变和胰高血糖结合研究（图4，补充表5）。共计检测了129个突变株，其中覆盖85个不同位置的110个突变株系的表达水平超过野生型的30%。与野生型相比，覆盖GCGR中7TM区域的28个不同位置的41个突变株与胰高血糖的结合减少四倍以上（IC₅₀）。这些GCGR突变的结果绘制在GCGR的7M区域晶体结构上（图5）。大多数在胰高血糖结合中起重要作用的残基在7TM核心区域朝向主要的空洞，并形成结合位点，这一结合位点部分覆盖ECL1、ECL2、ECL3以及螺旋I、II、III、V、VI和VII，而且延伸到7TM的空洞中。

为研究GCGR与胰高血糖的识别作用，我们建立了一个胰高血糖结合GCGR的结构模型，这一模型基于以下几方面：GCGR的7TM区域晶体结构，GCGR的ECD结构（PDB：4ERS），GCGR同源性GLP1R的ECD与GLP1多肽结合结构（PDB：3IOL）以及N端带帽的垂体腺苷环化酶激活性多肽（PACAP；PDB：1GEA）（图5a）。模型还包括了基于GLP1R和GLP1之间的光交联研究结果得到的实验性支持的GCGR与胰高血糖之间的距离限制因素。

预测的胰高血糖素与GCGR的ECD结合模式（图5b）与我们的实验结果（图4，补充表5）以及之前报道在GCGR和GLP1R上的突变研究结果相一致。图5b显示出GCGR上残基Asp63、Tyr65和Lys98是如何像在GCGR的ECD结晶结构中那样对ECD起稳定作用的，这种作用得到突变研究结果的支持（图4，补充表5）。对于胰高血糖素的C端区域来说，受体的Trp36侧链是一个很重要的疏水作用位点，就像在GLP1-GLP1R-ECD晶体结构中的Trp39那样。在GCGR的7TM晶体结构中见到的茎梗结构，在模型中将ECD与7TM区域连接起来（图5a，5b）。茎梗上的α-螺旋得到晶体结构中螺旋内相互作用的支持（Glu133-Lys136）以及模型中螺旋内相互作用的支持（Glu127-Gln131和Glu129-Lys132），而且似乎可以进一步通过与延伸的ECL1和胰高血糖的α-螺旋部分的相互作用得到稳定。具有α-螺旋的茎梗可能参与受体与胰高血糖素的结合作用，这一点得到实验结果的支持，即受体Ala135Pro的突变株显示与胰高血糖的亲和性降低（图4d，补充表5），这可能是由于茎梗区域的α-螺旋被扭曲而造成的结果。对于之前假设的胰高血糖素的中间连接铰链来说，茎梗部分也可能作为结合位点的一部分而行使其功能。基于受体和多肽配体残基之间交联实验的结果，最近有报道指出在GLP1R与GLP1多肽形成的复合物中在GLP1R区域可能存在一个α-螺旋构象。在GCGR-胰高血糖素的模型中，对应的残基对，F6-Cln142^1.40和Y10-Tyr138^1.36（使用单字母氨基酸缩写表示特指为胰高血糖素残基），相互靠近而且朝向对方，与GLP1R-GLP1复合物中假设的相互作用模式很相似。在GCGR-胰高血糖模型中L14-Trp295ECL2之间的12?距离超出了在之前的GLP1R-GLP1模型中（8-9?）交联距离的范围，尽管这可能反映了GCGR和GLP1R的配体结合模式的差异。

在B类GPCRs的7TM区域中并没有一个明确的多肽配体的结合位点的定位，这总是与ECL区域相关，或是与7TM区域中的口袋相关。GCGR-胰高血糖素模型描述了一种方式来解释多肽与ECLs的进一步的相互作用，也可以用来解释处于7TM区域深处残基之间的相互作用（图5c，d）。首先，GCGR晶体结构揭示出之前定位在7TM螺旋顶端或ECLs中的一些结合位点的残基实际上处于7TM区域中的深处。其次，胰高血糖素前五个残基伸展性灵活性的构象使其能够进入到结合口袋的深处。我们的模型对于胰高血糖素的处理引入了在残基F6-T7-Y10处多肽螺旋一种假设的N端带帽的构象，就像在与受体结合的PACAP上那样，尽管在这一区域其它形式的构象存在也是可能的。

由GCGR-胰高血糖素结合模型预测出的许多相互作用都得到了突变实验结果的支持（图4，5c，5d，补充表5），也得到了在GCGR和其它B类GPCRs上光交联研究结果的支持。在7TM区域中许多被预测与胰高血糖素具有相互作用的残基都显示出与胰高血糖素的强结合作用而并没有降低受体的表达水平（图4，补充表5）。图5显示了这些突变如何在GCGR-胰高血糖素模型中排列在7TM结合位点上，而且包括了那些处于口袋深处的残基（Tyr149^1.47，Val191^2.64，Gln232^3.37，Glu362^6.53和Leu386^7.43）。这些结果有力地支持胰高血糖素N端的伸展作用，这种伸展深深进入到GCGR的口袋区域，这一区域在A类GPCRs的配体结合中同样重要。

Figure 4 | Effects of mutation studies in GCGRsnake plot.
a, Mutated residues that show <4-fold(purple), 4–10-fold (orange), and >10-fold(red)changesof IC₅₀ values for glucagon binding withreceptor expression >30%of wild-type(SupplementaryTable 5). Mutation studies toinvestigatepeptide ligand binding have beenpreviously reported for several class BGPCRsincludingGCGR, GLP1R,GIPR,rSCTRandVPAC1 (Supplementary Table 6). The most conservedresidues in helices I to VII of class BGPCRs areboxedand shown in bold.
b–d, Representativebinding curves of GCGR mutants withglucagon.
Data are expressed as apercentage of specific ¹²⁵I-glucagonbinding in the presence of 0.02 nMunlabelled peptide. Each point (±s.e.m.)represents the mean value of at least threeindependent experiments done in triplicate(IC₅₀areshown in Supplementary Table 5).

图4 GCGR蛇形图中标注出的突变产生的配体结合发生的改变情况
a，配体结合降低情况通过颜色示出：小于4倍为紫色，4到10倍为桔色，10倍以上为红色，检测条件在突变表达水平大于野生型30%，与配体结合的IC₅₀变化值为标准。之前报道B类GPCRs的突变研究包括GCGR、GLP1R、GIPR、rSCTR和VPAC1。B类GPCRs螺旋I至VII中最具有保守性的残基被框注并示以黑体。
b-d，代表性GCGR突变与胰高血糖素的结合曲线。数据表示特异性¹²⁵I-胰高血糖素在0.02nM未标记多肽存在时的结合百分比。每个点（±s.e.m.）代表至少三次独立重复每次三个平行样实验的均值。

在环状结构区域，GCGR上残基Arg201、Tyr202、Asp208和Trp215或者稳定了ECL1的构象，或者直接与胰高血糖素发生直接作用（图5c，d）。GCGR-胰高血糖素结合模型进一步说明Trp295和Asn298残基直接与胰高血糖素作用，因为对于这些ECL2上残基的突变极大地影响了配体的结合。虽然残基Asp218、Cys224^3.29、Arg225^3.30、Lys286^4.64、Glu290和Cys294的突变（图4，补充表5）也影响了配体的结合，但这些残基在模型中并没有直接与胰高血糖素进行相互作用，而是起了一个适应胰高血糖素结合的环状构象的稳定作用。比如，ECL2和ECL1是通过Cys294和CYs224^3.29之间的二硫键得到稳定的，另外起稳定作用的还有可能在Lys286^4.64与Glu290以及Asp218与Arg225^3.30之间形成的盐桥作用。与此相似，我们假设Arg378在胰高血糖素结合中所起的作用是间接的稳定ECL3构象的作用，而Trp304^5.36则在螺旋V和VI之间的界面起稳定ECL2的作用。

Figure 5 | Model of GCGR bound to glucagon.
a, b, GCGR with the ECD(magenta) and 7TM domain (blue) bound toglucagon (green). Residues 122–
126 and 199–218 (brown) arenot defined in the GCGR ECD (GCGR-linker)(PDB: 4ERS) and 7TM domain (ECL1) crystalstructures, respectively. TheGCGRECD structure and the interactions between GCGR ECD and glucagonresemble those in the GCGR ECD (PDB: 4ERS)6and GLP1–GLP1R-ECDcomplex(PDB: 3IOL)8 structures, respectively.
c,d,The effects of mutationstudiesof individualGCGRresidues on glucagon (green) bindingmapped ontothe GCGR binding surface using the colorcoding presented in Fig. 4.Importantglucagon residues are labelled black. GCGR residues proposed to beimportant in stabilizing extracellularloops are boxed. GCGR–glucagon residuepairs that are homologous to residue pairsidentified in GLP1R–GLP1crosslinkingstudies12 are underlined.

图5 GCGR与胰高血糖素结合的模型
a，b，带有ECD（紫色）和7TM（蓝色）的GCGR与胰高血糖素（绿色）的结合。GCGR的ECD中残基122-126和7TM中残基199-218（褐色）并没有在晶体结构中得到解析。GCGR的ECD结构以及GCGR的ECD与胰高血糖素的相互作用分别模仿 GCGR的ECD（PDB：4ERS）和GLP1-GLP1R-ECD复合物（PDB：3IOL）的结构。
c，d，胰高血糖素（绿色）结合在GCGR结合面时使用与图4相同的颜色标示显示GCCR单个残基突变的结合情况变化结果。胰高血糖素上重要的残基示以黑色。GCGR上推测对胞外环状结构起稳定作用的重要残基被框住标示。那些与在交联实验中确认的GLP1R-GLP1残基对呈同源性的GCGR-胰高血糖素残基对使用下划线标示。

图5展示的GCGR-胰高血糖素模型是基于晶体结构证据的，并与大量的突变结合研究的结果相一致，因此这一模型为我们提供了大量的有关天然配体与其受体之间识别作用的内容。复合物的理论模型可以为揭示复杂结构性质的生物化学生物物理实验的设计提供一个有用的平台，也可以为能引导全长受体-配体复合物解析的稳定的构造物的设计提供平台。

B类GPCRs的相关内容
GCGR-胰高血糖素模型对于理解那些决定其它B类受体的配体识别作用的一般性特征是很有用的。通过在其它B类GPCRs同源性残基的突变研究会使GCGR突变研究的数据与以前的其它研究结果统一起来。补充表6列出了之前的274个突变研究的结果概要，这些突变的主体包括：GCGR、GLP1R、GIPR（gastricinhibitory polypeptide receptor）、rSCTR（rat secretin receptor）和VPAC1（vasoativeintestinal peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptidereceptor 1）。比如，与GCGR对齐排列后相当于GCGR上突变的残基有Tyr65^ECD、Tyr84^ECD、Leu85^ECD、Tyr145^1.43、Tyr149^1.47、Lys187^2.60、Ile194^2.67、Asp195^2.68、Leu198^2.71、Arg225^3.30、Gln232^3.37、Lys286^4.64、Glu290^ECL2、Trp295^ECL2、Asn298^ECL2、Phe365^6.56和Leu386^7.43，这些残基的突变显示对配体结合有影响作用，这一结果支持图5中GCGR-胰高血糖素的模型。这一模型证实那些被确认与胰高血糖素Q3、分泌素D3以及血管活性小肠多肽的D3的同源性残基具有相互作用的受体上的残基位于相当于GCGR的7TM区域中同样的局部（Lys187^2.60和Ile194^2.67），或是rSCTR（Tyr128^1.47,Arg166^2.60,Lys173^2.67和Asp174^2.68）以及VPAC1（Arg188^2.60和Lys195^2.67）。

GCGR的7TM区域特异性结构特征和较大的结合口袋为多肽配体结合的分子细节提供了新的内容，而且为治疗II型糖尿病的特异性小分子的设计提供了一个可靠的结构模板。还有，B类GPCR结合位点明显的重叠说明尽管B类GPCRs之间存在结构差异，GCGR晶体结构可能为构建描述多肽类配体与其他B类GPCRs之间的相互作用的模型提供了新的机会。这特别对于那些参与葡萄糖调节作用的受体如GLP1R和GIPR来说是一件令人兴奋的事。（全文完）