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【求助】求助单酶切插入基因片段问题 [病例帖]

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楼主

入门站友

1楼

这个帖子发布于7年零62天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

我现在要改造一个载体pHT43（8050bp），在KpnI单酶切位点插入一段820bp的序列，遇到了一些问题。过程就是把载体和基因片段都KpnI单酶切之后，载体做了去磷酸，T4连接之后转化DH5α大肠感受态，然后结果发现插入片段的引物做菌液鉴定是阳性，但是酶切之后发现一个正确的目的条带和一个比原pHT43质粒小了很多的载体片段，不知道什么原因。
后面有尝试过载体不做去磷酸，都是一样的结果，就是连接之后载体片段变小了，有高人支招么

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2013-05-09 17:35 浏览 : 1271 回复 : 2

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reyesa

丁香园准中级站友

2楼

spritfood
我现在要改造一个载体pHT43（8050bp），在KpnI单酶切位点插入一段820bp的序列，遇到了一些问题。过程就是把载体和基因片段都KpnI单酶切之后，载体做了去磷酸，T4连接之后转化DH5α大肠感受态，然后结果发现插入片段的引物做菌液鉴定是阳性，但是酶切之后发现一个正确的目的条带和一个比原pHT43质粒小了很多的载体片段，不知道什么原因。
后面有尝试过载体不做去磷酸，都是一样的结果，就是连接之后载体片段变小了，有高人支招么

这个是有点奇怪。直接测序看看？

2013-05-09 23:08

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onces

铁杆站友

3楼

很可能是Kpn1过量酶切或是酶切时间过长，导致在其它位点非特意酶切！直接测序列了！还有载体应该有其它酶切位点，试试其它双酶切！

2013-05-10 08:49

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