发帖
每发1个新帖
可以获得0.5个丁当奖励
回帖

【专题讨论】原核表达条件优化！ [精华]

只看楼主
页码直达：
直达末页

楼主

PRP

丁香园准中级站友

+1 积分
1楼

这个帖子发布于15年零347天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

本人做原核表达，开始条件不管如何改变都未见融合蛋白有明显表达,经过一番摸索获50%蛋白表达量，此文为本人硕士论文一部分，在此抛砖引玉，希望大家发表一下关于原核表达条件优化的看法,期待中..........

原核表达条件优化.doc(162.5k)

邀请讨论

搜索

2003-07-10 10:40 浏览 : 83580 回复 : 339

投票 9
收藏 152
打赏
引用
分享
- 微信扫一扫
- 新浪微博
- 丁香客
- 复制网址
举报
- 广告宣传推广
- 政治敏感、违法虚假信息
- 恶意灌水、重复发帖
- 违规侵权、站友争执
- 附件异常、链接失效
- 其他

biosepq 编辑于 2005-10-12 11:52

• 肺部改变，男，48岁，脑出血卧床三年，高血压，意识不清。

收起全部有料回复

mcli

微生物与免疫学系

丁香园荣誉版主

+1 积分

热

26楼

我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：
1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。
2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。
3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。

2003-08-02 00:50