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【求助】如何检测分子伴侣自噬

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楼主

3312006001

入门站友

1楼

这个帖子发布于8年零277天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

请问各位大侠，如何检测分子伴侣自噬啊？检测分子伴侣自噬关键信号蛋白用提取溶酶体吗？

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2012-02-23 10:09 浏览 : 4731 回复 : 5

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liubingood

丁香园版主

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2楼

分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：指的是一些分子伴侣，如hsc70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（**1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（**2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异。
5）MDC染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
所以，以上方法检测的自噬包括了CMA，以及通常所说的自噬，并没有看到专门检测CMA的方法。

2012-02-24 19:16