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【求助】请教各位高手，质粒提取老是出现一条杂带，是什么原因呢？

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楼主

入门站友

1楼

这个帖子发布于9年零162天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

各位高手帮帮忙啊，我做连接转化一个多月了均未果，请教各位原因。
我的目的基因是1800bp，连入PMX载体（5800bp）后双酶切鉴定正确，但开始没注意2500bp位置有一条很弱的杂带。后来提去内毒素质粒时发现产量怎么也提不高，以前实验室的师兄师姐们也提过这种大片段质粒，产量很高而且没有这条杂带。拿以前师兄做出来过的菌划板提出来的质粒竟然也出现了杂带，之前师兄做时是没有这条杂带的。

怀疑是污染了别的质粒进去了，但我验证了感受态没问题，在LB平板上不长，提质粒没有条带。培养基，平板，摇菌管，氨苄都换了新的。然后又把质粒单切，胶回收线性条带，连接后转化，提出来的质粒还有这条杂带。

实在不知道是什么原因了!难道一个菌可以进入两个质粒吗？看电泳图赶紧好像是两套质粒的条带。请各位高手帮忙分析一下原因，怎么解决这个问题。谢谢！

泳道1和泳道3：用质粒转化后挑的2个单菌落提取的质粒，泳道3明显是一个杂质粒。泳道2是酶切，但2500bp杂带

不能切开。泳道4又能把泳道3质粒切开。奇怪！难道这个杂带跟泳道3质粒还不是一个东西？

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2011-08-15 10:56 浏览 : 14439 回复 : 10

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zhouchaoying100 编辑于 2011-08-17 08:39

• 死亡患者危重讨论怎么写？

westernblotx

铁杆站友

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2楼

这个尤其在试剂盒提取的过程中会遇到。Axygen试剂盒的说明书是这样解释的：“……偶尔也会在超螺旋条带前面出现微弱的称谓‘不可逆变性质粒’条带，这个是碱裂解的副产物。大多数没对这种质粒不起作用，包括限制酶和测序的酶。如果在S2（指的是裂解液）环境中时间过长，会使得不可逆变性的质粒含量增加。”试剂盒给出的建议是在裂解液中的时间不要超过5 min。

这个我也遇到过几次，尤其是一次提很多质粒的情况下，容易出现这个问题。在以前的文章中，有讨论“Ghost band”的，这种情况大概就是属于其中的一种吧。

至于你提取的质粒浓度不高，这个应该和这种条带没有直接或者必然的联系。我个人经验认为他也不影响后续实验，所以我一般不管他。如果你想尝试解决这个问题，尝试缩短理解时间，一般加入裂解液混匀后就直接加入中和液，也许可以使该问题得以解决。或者尝试用较好的质粒提取试剂盒，比如qiagen的或者invitrogen的，看是不是能够解决这个问题。

good luck！

2011-08-15 19:52

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westernblotx 编辑于 2011-08-17 13:16

• 一天吃200片复方甘草片连续吃两年，停药后戒断症状有咳嗽这个表现吗？

westernblotx

铁杆站友

3楼

2011-08-17 13:18

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• 新冠疫苗十问十答，你想知道的都在这里

楼主

zhouchaoying100

入门站友

4楼

westernblotx
这个尤其在试剂盒提取的过程中会遇到。Axygen试剂盒的说明书是这样解释的：“……偶尔也会在超螺旋条带前面出现微弱的称谓‘不可逆变性质粒’条带，这个是碱裂解的副产物。大多数没对这种质粒不起作用，包括限制酶和测序的酶。如果在S2（指的是裂解液）环境中时间过长，会使得不可逆变性的质粒含量增加。”试剂盒给出的建议是在裂解液中的时间不要超过5 min。

这个我也遇到过几次，尤其是一次提很多质粒的情况下，容易出现这个问题。在以前的文章中，有讨论“Ghost band”的，这种情况大概就是属于其中的一种吧。

至于你提取的质粒浓度不高，这个应该和这种条带没有直接或者必然的联系。我个人经验认为他也不影响后续实验，所以我一般不管他。如果你想尝试解决这个问题，尝试缩短理解时间，一般加入裂解液混匀后就直接加入中和液，也许可以使该问题得以解决。或者尝试用较好的质粒提取试剂盒，比如qiagen的或者invitrogen的，看是不是能够解决这个问题。

good luck！

灰常感谢！我按照您说的去做一下。但是对于第一幅图，我用目的质粒转化后，怎么还提出来别的质粒呢？按理说挑的单克隆菌落不是应该全是我的目的质粒吗？

2011-08-18 09:24

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