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形态学与生理生化

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论坛首页  >  形态学与生理生化讨论版   >  系统生物学|化学生物学
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【求助】请教各位高手,质粒提取老是出现一条杂带,是什么原因呢?

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楼主 zhouchaoying100
zhouchaoying100
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这个帖子发布于9年零156天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位高手帮帮忙啊,我做连接转化一个多月了均未果,请教各位原因。
我的目的基因是1800bp,连入PMX载体(5800bp)后双酶切鉴定正确,但开始没注意2500bp位置有一条很弱的杂带。后来提去内毒素质粒时发现产量怎么也提不高,以前实验室的师兄师姐们也提过这种大片段质粒,产量很高而且没有这条杂带。拿以前师兄做出来过的菌划板提出来的质粒竟然也出现了杂带,之前师兄做时是没有这条杂带的。

怀疑是污染了别的质粒进去了,但我验证了感受态没问题,在LB平板上不长,提质粒没有条带。培养基,平板,摇菌管,氨苄都换了新的。然后又把质粒单切,胶回收线性条带,连接后转化,提出来的质粒还有这条杂带。

实在不知道是什么原因了!难道一个菌可以进入两个质粒吗?看电泳图赶紧好像是两套质粒的条带。请各位高手帮忙分析一下原因,怎么解决这个问题。谢谢!


泳道1和泳道3:用质粒转化后挑的2个单菌落提取的质粒,泳道3明显是一个杂质粒。泳道2是酶切,但2500bp杂带

不能切开。泳道4又能把泳道3质粒切开。奇怪!难道这个杂带跟泳道3质粒还不是一个东西?

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2011-08-15 10:56 浏览 : 14419 回复 : 10
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zhouchaoying100 编辑于 2011-08-17 08:39
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楼主 zhouchaoying100
zhouchaoying100
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westernblotx
这个尤其在试剂盒提取的过程中会遇到。Axygen试剂盒的说明书是这样解释的:“……偶尔也会在超螺旋条带前面出现微弱的称谓‘不可逆变性质粒’条带, 这个是碱裂解的副产物。大多数没对这种质粒不起作用,包括限制酶和测序的酶。如果在S2(指的是裂解液)环境中时间过长,会使得不可逆变性的质粒含量增加。”试剂盒给出的建议是在裂解液中的时间不要超过5 min。

这个我也遇到过几次,尤其是一次提很多质粒的情况下,容易出现这个问题。在以前的文章中,有讨论“Ghost band”的,这种情况大概就是属于其中的一种吧。

至于你提取的质粒浓度不高,这个应该和这种条带没有直接或者必然的联系。我个人经验认为他也不影响后续实验,所以我一般不管他。如果你想尝试解决这个问题,尝试缩短理解时间,一般加入裂解液混匀后就直接加入中和液,也许可以使该问题得以解决。或者尝试用较好的质粒提取试剂盒,比如qiagen的或者invitrogen的,看是不是能够解决这个问题。

good luck!

灰常感谢!我按照您说的去做一下。但是对于第一幅图,我用目的质粒转化后,怎么还提出来别的质粒呢?按理说挑的单克隆菌落不是应该全是我的目的质粒吗?
2011-08-18 09:24
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楼主 zhouchaoying100
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hualala321
不要想太多了,也不要想太复杂了。如果确定没有污染,就不会有其他的质量存在。

出现这个问题应该是你的手法的问题。比如溶液1、2、3的时候手法过于剧烈,导致DNA螺旋的断裂,那么跑胶的时候就会出现两条带,这个问题可以用测序的方法确认一下,两条带是否相同的DNA.

如果两者相同,那么还有种可能是你最后用TE溶解的过程比较短,质粒没有完全溶解。

希望对你有帮助。

谢谢!但是我和2个师兄最近都遇到了这个问题,我们3个以前提的质粒也没有出现这种问题,同样的试剂盒,同样的操作过程,一直用的BIOMIGA的质粒小提试剂盒。应该不是手法的问题吧?不过我昨天提了一管去内毒素质粒,浓度又有850ug/ml了。之前提了4次,浓度一直只有100ug/ml左右,而且是不同的人提的。
2011-08-18 15:50
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楼主 zhouchaoying100
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westernblotx
转化子并不一定都是重组子,总是有一定的假阳性。有的时候会得到一些跟载体大小相当的质粒。你第一幅图有两个问题,第一,没有对照。也许你的载体是线性化的,但是你可以找一个跟你的重组质粒大小相近或者比它小点的质粒作对照。第二,3道的质粒能够被切开并不能说明他是其他质粒,因为你不是从同样一管培养液提出来两个质粒,而是分别从不同的转化子提取出来不同的质粒,它能够被酶切说明他很有可能是空载体。

谢谢~~您说的“也许你的载体是线性化的”我不太明白意思。我们把实验室去年做出来过的质粒保存菌重新划板挑菌提质粒,发现电泳图也有同样的杂带,查看去年的电泳图是没有问题的。下图是刚跑的电泳:
有没有可能是实验室的空气污染了?
2011-08-18 16:58
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