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神经生物

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论坛首页  >  神经生物学讨论版   >  细胞培养
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【求助】神经元培养 持续更新:种板出芽后,胞体突起消失并漂浮死亡(附多图)。

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楼主 yincheng431
yincheng431
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这个帖子发布于10年零46天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
认真研读过holywater的大作“世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华] http://neuroscience.dxy.cn/bbs/topic/17651341”,然后自己也开始用消化法养小鼠皮质神经元(以前自己一直使用机械法培养神经元),但是养了5次最终神经元都是漂浮死亡,现将过程和图片放上,希望求得大家帮助。谢谢~!

1 使用新生24h的c57乳鼠2只。

2 取出脑组织后,冰上DMEM高糖中仔细剥离脑膜,手术刀迅速切碎脑组织到0.5mm以下直径。

3 加入即时配置的6ml木瓜蛋白酶(geneview公司),木瓜蛋白酶浓度2mg/ml,同时加入Takara公司DNA酶2ul,混
匀后置于37度孵箱30min,间断摇动3次,整个消化过程都在35毫米的皿内。

4 加入10%小牛血清6ml反应。

5 使用Oxygen进口1ml*头极其缓慢的吹散消化后组织块,总共吹3遍,每遍10次(吸吹一次控制在3秒钟左右),第一遍吹后吸走上层细胞然后加入DMEM高糖继续吹第二遍,如此重复。

6 800转离心8min后弃去上液,加入Neurobasal+Gibico胎牛血清(10%)+Gibico双抗的培养液,血细胞计数后种6

孔板,每孔细胞70万个(后来也曾种过每孔110万个)。

7 培养板用过德国grenier公司和经常用的costar公司的,sigma多聚赖氨酸(货号P1274 Poly-L-lysine hydrobromide

分子量70,000-150,000 by MALLS),多聚使用浓度(0.1mg/ml和10ug/ml都用过),上述浓度多聚铺板后,置于

37℃孵箱过夜或者10h以上,种板前吸干多聚,PBS冲洗2遍,超级台中晾干后种板。(也用过多聚在37℃铺板

30min后吸干多聚然后再37度孵箱过夜,种板前PBS冲洗2次后种板)。

8 种板后在4-8h全量换液为Neurobasal+B27+Gibico双抗的培养液。

然后自己遭遇的问题是:
种板后4h可以看到神经元胞体长大,少量神经元胞体长出轴突。但是在8-24h后神经元发出的轴突消失,随后的2-3天中,原本贴壁的神经元却漂浮死亡,最后板子上很空,什么都有没有,而培养基没有浑浊。。。。。自己一遍一遍的想是什么原因同时调整试验细节,但是还是没有办法。在此恳请大家帮忙。

如下是部分图片。
图一:种板后立即照相的


图二:种板后8小时


图三:种板后12小时。


图四:种板后3天。


自己试验时间很紧迫,恳请大家的帮助,在此先谢谢大家了~~~
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2011-03-11 11:26 浏览 : 15170 回复 : 67
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yincheng431 编辑于 2011-03-17 21:27
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holywater
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两个可能,第一是你吹打的过度,这可不是吹打细胞系那样,实在不行的话,用玻璃管吹打,口径加大些;3秒钟太快了,要缓慢吸,缓慢吹;吸吹一次15-20秒钟还差不多;
第2是你的多聚赖氨酸问题,一般只要铺板5-30分钟,吸干后要晾4小时-24小时,然后洗1-2次。铺板时间没必要过长,但是晾板时间要很长;

第3,你用了国产的培养板;这里用的东西只有实验者是国产的;
2011-03-11 16:46
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楼主 yincheng431
yincheng431
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非常感谢holywater的及时回复,我接下来就按照您的建议去做。

在下还有点疑惑想问问,恳请不吝指点的啊:

1 多聚铺板吸干后晾干,请问是在37摄氏度的孵箱中晾干还是在常温中晾干的呢?在晾干的时候需要揭开还是盖上
培养板的盖子的呢?这个细节自己一直不大清楚,查了很多文献也没有找到这个细节,倒是有文献说不能用玻璃
而非得用无毒塑料容器来装多聚的液体,谢谢啊。

2 自己的木瓜蛋白酶是2000单位/mg(geneview公司),不知道对于2个c57小鼠皮质使用6ml该浓度的木瓜酶37℃
消化半小时是不是太长了,但自己又担心浓度或时间不够到时候吹不下来细胞。

3 请问分步吹打之后,为了调整种板浓度一般都需要离心,恳请给一个一般的神经元离心的转速(或g数)和分钟数
建议。

先谢谢您了
2011-03-11 20:31
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yincheng431 编辑于 2011-03-11 20:37
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楼主 yincheng431
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自己来顶一个,希望有经验的同行都来谈谈,呵呵,感谢!
2011-03-12 19:20
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