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【求助】请高手帮解决染色体制备过程中的问题！

sunshijie12345
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2010-09-27 22:52 消息 引用 收藏 分享 只看楼主
在下有几个问题，请各位染色体制备方面的专家指导下：

1. 我做血液淋巴细胞培养，每次种20-25滴，可是为什么有些人的细胞不怎么长呢，可能有哪些因素影响？该怎么改进呢？（我用的是达辉和湘雅的培养液）

2. 染色体制备过程中，细胞低渗多少时间比较好呢？很多单位同仁都是37度低渗20-30分钟，可是我低渗这个时间的话细胞质很多，而且染色体短小且不分散，是什么原因导致的差异呢？如何才能有效的去除细胞质的残留呢？（细胞固定后是否要用力吹打呢？）

3. 很多时候同样条件制备的一批细胞染色体，滴片干燥后在倒置显微镜下观察，发现有些比较好，但也有些细胞和染色体都发亮，且染色体都很短。请见图，右边的图片的染色体分散较好，间期细胞也铺得也比较好，细胞和染色体较暗，都比较清晰，而左边图片的细胞和染色体都发亮，并且染色体形态和分散都理想，特别是染色体比较短小，开始我以为是固定效果不好，后来固定过夜但是情况还是没有得到改善。请各位高手帮助解析其原因并该如何解决这个问题，这个问题困扰我很久了，希望各位高手不吝赐教！

非常感谢！
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sunshijie12345 edited on 2010-09-27 23:00 举报
随意的风
随意的风

医师认证心血管内科

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2010-09-28 18:53 消息 引用 收藏 分享
我做染色体已经几年了，谈一下我的感受，交流一下：
1. 不知道你培养液的毫升数，如果细胞不生长，你可以试着减少种血，让细胞有更多的营养。接种完最好立刻放入培养箱。
2. 我们实验室低渗是37度30分钟，，不知道你是水浴还是放在恒温箱，水浴效果可能好一些，这样低渗比较充分。如果室温较低，可稍微延长低渗时间。
3. 实验过程中最好保持一定的湿度温度，尤其是湿度，我们发现恒定的湿度对于染色体的分散很重要。冬天我们一般把湿度升高到50%，和未升高湿度滴片效果有很大差别。
4. 关于用力吹打的问题，可能因每个人手法不同而不同。低渗前可以稍微用力一些，但低渗后建议用力不要过大。用力大不能解决分散不好的问题。
5. 还有就是滴片的手法和高度，建议你选择适合自己的方法。
6. 不知道你烤片的方法，是过酒精灯还是放入烤箱。如果效果不好，你可以尝试一些别的方法。
希望你实验顺利，有问题咱们可以再交流。
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sunshijie12345
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2010-09-28 22:48 消息 引用 收藏 分享
谢谢楼上的专家！
1， 我们的培养液都是5ml，我也试过少加血（如15-25滴），但是培养效果均为有些好，有些不是很理想。
2， 我们实验室低渗是37度40分钟，是水浴的，湿度我倒没怎么注意，湿度多少效果比较好啊？是越高越好吗？低渗都是在水里的，湿度为什么会有那么大的影响呢？
3，考片，我们是80度考3个小时。
同样是一样的条件，为什么有些好，有些效果不是很好呢，另外，请帮在下分析下我上面的两幅图片，解决下上面的第三个问题！
谢谢
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sunshijie12345
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2010-09-29 23:00 消息 引用 收藏 分享
请各位高手多多指导！！！
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langc
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医师认证普外科

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2010-10-10 19:53 消息 引用 收藏 分享
先申明：本人就一打杂的，并非专家，不过在旁边看多了，偶有所得，看到这个哥们的帖子一时手痒，就来个抛砖引玉吧，在下看sunshijie12345说用的培养基是湘雅的，难道你是湖南的？
1湘雅的接种我所知道的好像一般采用16-18滴的样子（现在不知道有没有新的方式），记得以前老师说接种太多细胞密度过大可能会导致相对营养不良，细胞生长不好...
2,培养箱温度是否稳定，温度的影响不能小视，细胞培养的温度37度波动范围不超过+/-0.5度最佳。

3.低渗时间一般是20到30分钟的样子就可以了，我以前刚开始的时候也曾经用过40分钟的，结果分裂相基本上没有了...哭...后来用20到30分就正常了，不过楼主加秋的量不知道如何，这个对分裂相也有影响的

4。细胞质残留的问题，可能跟固定剂有关系，甲醇和冰醋酸的本身质量，两者配比关系的质量...还有就是尽量不要使用配置时间过久的固定剂，如果是固定剂的问题的话，再怎么用力吹打也 没有什么效果

5.同一批同时收细胞，有的片子上面的染色体短小精悍，一看就很扎实的感觉，比如左边的图；有的片子的染色体匀称修长赏心悦目，比如右边的图，我也不知道为什么，猜想是不是和湿度有关系，
随意的风的几点说得真好，请问你们对湿度这个问题如何控制和把握的?我一直想对这方面也进行探索和控制，但是不知道从何着手，是控制滴片环境的湿度还是烤箱内的湿度呢？还请老大不恁赐教谈谈宝贵经验，谢谢.
个人的一点粗浅看法，仅做参考
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pnas
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2010-10-12 19:02 消息 引用 收藏 分享
1. 我做血液淋巴细胞培养，每次种20-25滴，可是为什么有些人的细胞不怎么长呢，可能有哪些因素影响？该怎么改进呢？（我用的是达辉和湘雅的培养液）

影响因素：

A患者白细胞数量，确切的说是T细胞数量，太低的话细胞密度不够，分裂相相对少，如患者有免疫缺陷等，T细胞不足就会影响培养。接收标本时应注意患者有无相关病史，如有的话需参考血常规白细胞数进行接种。

B培养基质量，不管哪里产的培养基，总有一定的批次间差异，质控做的好一点的公司就稳定一点，个人认为湘雅培养基在这一点上有待改进；此外还和培养基的有效期、保存条件有关，考虑到运输条件，夏天的培养基有效期相对会短一点，应注意季节差异；培养基最关键的是所用的血清品质和PHA效价，如果这两点能保证的话质量应该没问题；作为使用者应多试几家厂家的培养基，选择质量稳定的产品，或做用两个厂家的培养基各一瓶同时培养，注意不要反复冻融培养基，解冻后的培养基放4度冰箱即可。

C关于种血的量，理论上初始细胞密度不宜大于10的6次方/ml，有兴趣的可以自己算一下。实际操作中0.2ml-0.5ml都是可以的，合格厂家的培养基至少可以保证培养4天，所以不必当心培养基营养不够的问题，当然偷工减料的另当别论。

D温度，37度恒温最好，波动不宜超过上下0.5度。培养箱的选择也很关键，建议使用进口的，国产的稳定性相对差一点。

2. 染色体制备过程中，细胞低渗多少时间比较好呢？很多单位同仁都是37度低渗20-30分钟，可是我低渗这个时间的话细胞质很多，而且染色体短小且不分散，是什么原因导致的差异呢？如何才能有效的去除细胞质的残留呢？（细胞固定后是否要用力吹打呢？）

A低渗时间：15分钟足够了，多了浪费，不信的可以试试。

B低渗浓度：75mM Kcl；配的时候不可能那么准，水可以稍微多加点，终浓度不要超过75mM就好，另外吸弃上清的时候在保留细胞的同时尽可能把原有等渗的培养基吸掉，如果留的太多，等于变相增加低渗浓度，效果自然不好了。

C低渗温度：建议37度，实验室温度恒定的也可以室温，低渗时间加5分钟。

D细胞质多，不一定是低渗的问题，也可能是固定不彻底或分散的问题。甲醇有助于胞浆的清除，可以增加固定液中甲醇的比例至4：1固定一次，再换回正常比例的固定液固定1-2次。固定液现配现用，上午配的下午就不要用了。

E吹打：低渗时只要把细胞与低渗液混匀即可，没必要用力吹，我们一般吸上清后加1ml低渗液，涡旋混匀器混匀，再加6-7ml低渗液，再盖盖子震荡几次，上水浴箱，不用猛吹猛打，起不起泡沫也没关系。有些实验室光吹打就花很长时间，完全没有必要。预固定之后因为细胞相对比较脆弱，所以操作不宜过重，用手指弹管底使沉淀松散，来回颠倒几次混匀就好了。

3. 很多时候同样条件制备的一批细胞染色体，滴片干燥后在倒置显微镜下观察，发现有些比较好，但也有些细胞和染色体都发亮，且染色体都很短。请见图，右边的图片的染色体分散较好，间期细胞也铺得也比较好，细胞和染色体较暗，都比较清晰，而左边图片的细胞和染色体都发亮，并且染色体形态和分散都理想，特别是染色体比较短小，开始我以为是固定效果不好，后来固定过夜但是情况还是没有得到改善。请各位高手帮助解析其原因并该如何解决这个问题，这个问题困扰我很久了，希望各位高手不吝赐教！

A分散：分裂相的分散程度与滴片时的条件有关，最佳条件相对湿度50-55%，温度25，其中最关键的是湿度。实验室能做到恒温恒湿的最好，湿度不够的可以买个空气加湿器改善条件，冬天效果尤其明显，湿度过大的话可以开空调除湿。

B染色体长短：跟加秋时间和细胞周期的具体时相有关，加秋时间越长，大部分的分裂相越短。

C滴片高度：这也是一个存在认识误区的环节，我们的经验是只要保证的滴片时的温度和湿度，染色体的分散效果和滴片高度无关（我们是用中枪贴着玻片滴片的，基本是零高度）！事实上中期细胞膜的破裂是在与玻片接触后十几秒后发生的，而不是想当然的在接触的那一瞬间发生，所以与高度无关，不管悬液以何种高度滴下均不会影响分散效果.
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pnas edited on 2010-10-12 19:07 举报
sunshijie12345
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2010-11-03 09:51 消息 引用 收藏 分享
多谢各位的关注，特别谢谢pnas、langc、随意的风等几位兄弟的指导与帮助！

非常感谢楼上几位兄弟的指导，通过我的实验证明你们所谈到的问题，确实很有指导意义，确实是多年经验总结，也是影响实验的几个关键原因。

在你们的指导下，最近我的染色体制备效果比较满意，但是现在又有新的问题了，虽然现在染色体制备的效果不错，但是显带效果极差！

消化后染色发现，要么染色体不消化，要么延长时间后染色体都消化模糊了，就是不显带，或者显示的带不清晰，非常难看，非常奇怪。但次消化液和染料对羊水细胞染色体显带效果还是不错的。

我的实验关键步骤也列出来给大家分析下：

接种：一般23滴（1岁以下20滴）
最初离心：2500转10min
低渗：6--8ML，37度 ，现在时间我缩短到了20min（以前是40mim，根据楼上各位兄弟的建议确实15-20min九足够了）
预固定：1ml，固定5min
离心去上清，加固定液
然后马上再离心去上清，再加固定液，固定10min
离心去上清，再加固定液，固定10min
离心去上清，滴片。
80度烤箱烤3个小时（一般是晚上6点到9点），然后我第二天早上约9点开始染片。都几批了，效果特差，这次的简直没法分析了，我现在都不敢染了，现特地来向各位请教。请各位再帮我分析下，主要是什么原因，该如何解决，谢谢！
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pnas
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2010-11-06 10:40 消息 引用 收藏 分享
接种：一般23滴（1岁以下20滴）

基本没问题

最初离心：2500转10min

可以考虑1000-1500转，最初离心转数高一点无所谓，但如果预固定后还是2500转有可能把一部分中期细胞离破，次数越多损耗越大，虽然外周血细胞基数大，哪怕一半损耗剩下的也足够分析了，但还是建议掉低一点，就像低渗20分钟一样，1500转已经足够了，没必要太高。

低渗：6--8ML，37度 ，现在时间我缩短到了20min（以前是40mim，根据楼上各位兄弟的建议确实15-20min九足够了）

没问题

预固定：1ml，固定5min

预固定可以不用加那么多，记得看过一篇文献是说预固定液加的越多反而影响后续的结果，理想比例大概是2～5%左右（？记不清了），一般加个0.5ml足够了。老外是 a few drops ，也不会太多。
我们加完预固定液，混匀后就直接离心了，没什么差别，所以这5分钟可以省下来。

离心去上清，加固定液

没问题

然后马上再离心去上清，再加固定液，固定10min

固定两次后看固定液颜色如果没去干净再加一次。

离心去上清，再加固定液，固定10min

滴片前先放-20度冰箱冰一下，冰的固定液效果更好

离心去上清，滴片。

80度烤箱烤3个小时（一般是晚上6点到9点），然后我第二天早上约9点开始染片。都几批了，效果特差，这次的简直没法分析了，我现在都不敢染了，现特地来向各位请教。请各位再帮我分析下，主要是什么原因，该如何解决，谢谢！

玻片老化各地不一样，有的75×3（老夏的经典方法），有的90×1.5；有的60～65过夜，老外还猛一些，有的微波炉烤几分钟，有的紫外照1分钟，都可以，爱用那个用哪个。

带纹的问题我们也遇到过，感觉主要有这么几个影响因素：1 玻片干净程度，没洗干净，沾了油的玻片显带效果很差。2 胰酶保存时间太长，效价不行。3 由于甲醇冰醋酸批次间差异，固定不彻底。4 染液质量差，另外染液的pH值也是一个影响因素，一般理想条件是6.8。你可以分析一下羊水片子和外周血收获过程和用的试剂耗材有什么差别，一次换一种条件，找找原因看，最后祝你好运。
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sunshijie12345
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2011-01-19 17:18 消息 引用 收藏 分享
各位战友，我把所有的影响试剂和条件都试过或换过了，但是效果还是很差，现在附上图片，请各位高手指点，看看你们能不能看出是哪方面的原因？
1. 玻片我洗过很多次了，用洗洁精、酒精等都试过，但效果都不理想。
2. 固定对显带有什么影响？固定不彻底会影响染色体的分散，但是对显带的影响到底如何？
3. 胰酶现在都是用最新进口SIGMA的胰酶
4. 染料的话，由于羊水的效果还比较好，应该不会是燃料的原因吧！

下面是最近的实验效果图，请各位高手指点，谢谢！
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sunshijie12345
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2011-01-20 11:00 消息 引用 收藏 分享
等待中……
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兔子705
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2011-01-27 08:47 消息 引用 收藏 分享
看见这么多的战友发表自己的观点，我也来凑一下热闹。
我们实验室也是刚建立起来的，做外周血的时候也遇到过很多的问题，不过先在我们做得很稳定，谈一下我自己的感受。1
1.接种：我们用的是湘雅公司的成品培养基（我老师在湘雅进修的），成人接种20-25滴，四岁以下儿童接种的15滴，新生儿接种的10滴
2.低渗：我们水浴低渗30分钟，低渗液0.075mol/l的kcl（这一步很关键，要充分吹打悬液，我们几乎要吹打30秒左右）
3.固定：我们标本不是很多，每次都是上午固定好下午上班的时候就滴片，效果也很好啊。
4.滴片：高度一定要掌握好，一般10-15cm高度可以分散得比较好
这就是我们实验室最关键的几步，希望我们的经验对你们有用。
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sunshijie12345
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2011-01-27 14:46 消息 引用 收藏 分享
谢谢楼上的兄弟的关键点评！讲得都是重点！

烦请有经验仁兄帮看看我显带的问题。（请见楼上的图片）

并请各位实验室的兄弟能否讲下贵实验室染料缓冲液的配方，谢谢！
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pnas
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2011-02-16 15:11 消息 引用 收藏 分享
各位战友，我把所有的影响试剂和条件都试过或换过了，但是效果还是很差，现在附上图片，请各位高手指点，看看你们能不能看出是哪方面的原因？
1. 玻片我洗过很多次了，用洗洁精、酒精等都试过，但效果都不理想。

玻片的洁净度不同厂家有很大差异，所以一般要自己洗一遍，有条件的话准备一个酸感缸泡一泡会更干净，现在国内玻片做的比较好的是江苏世泰的玻片，可以直接用，基本不用洗（靠边的两张会有点脏，直接抛弃）；帆船的牌子烂了，不同厂家很多都叫帆船，质量不能保证。

2. 固定对显带有什么影响？固定不彻底会影响染色体的分散，但是对显带的影响到底如何？

经验上感觉固定不彻底，显带就不好，但是具体原因不知道；染色体分散，主要的三个因素：湿度，温度，气流。

3. 胰酶现在都是用最新进口SIGMA的胰酶

胰酶应该没问题

4. 染料的话，由于羊水的效果还比较好，应该不会是燃料的原因吧！

应该没问题

从图片上看，带纹比较花，我们有时也会有这种现象，怀疑有可能跟玻片的干燥程度（烤片时间）或染色时的湿度有关，建议增加烤片时间或提高温度试试看。85度3小时甚至更长也没关系的，不会老到哪里去。
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sunshijie12345
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2011-02-20 19:58 消息 引用 收藏 分享
谢谢pnas的指导！
我试过烤片的时间，感觉对显带质量提高不是很理想，我现在感觉有点像跟染色体粗细有关，如果染色体比较粗，好像染色体显色就不理想。还在摸索中，请各位关注！
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alcohol_ayd
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2011-02-24 15:05 消息 引用 收藏 分享
建议：提高固定液甲醛：冰乙酸比例；老化，试试50度过夜；稀释胰酶现有浓度，适当延长消化时间，以上观点仅供参考！
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sunshijie12345
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2011-02-25 16:04 消息 引用 收藏 分享
OK.谢谢楼上兄弟的建议，我按照您的建议实验后再来汇报结果！
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jiangmeijie
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2011-03-13 09:22 消息 引用 收藏 分享
请教用低渗的氯化钾用不用高压的？胰酶得浓度到底怎么配？
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sunshijie12345
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2011-04-09 21:16 消息 引用 收藏 分享
谢谢各位的关注，最近我终于发现问题所在，以前配胰酶我用的是生理盐水，我现在换了磷酸缓冲液效果就好了！

现在对实验过程方法等有些了解了，以前对实验某些步骤有些误解，现在做了这么久，总算摸索到一些规律：

染色体实验的重点：

1.接种：成人接种20-25滴，四岁以下儿童接种的15滴，新生儿接种的10滴 （这个很好，很重要）

2.低渗：我们水浴低渗30分钟，低渗液0.075mol/l的kcl（37度30min绝对OK！）

3.固定：固定三次为好！（每次十分钟足矣。）

4.考片：80度2h-3h。

其它的什么天气湿度，滴片高度，干片或湿片等我都实验过，对染色体的制备都没什么影响！（请相信，这绝对至少亲自实验过3个月以上得出的结论。）



楼上的同学，低渗液不需要高压的，我们配500ML用半个月，效果没有影响。
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hongliling
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2011-08-29 08:33 消息 引用 收藏 分享
我最近也在做染色体畸变试验,但是遇到了点问题,希望各位能帮忙解决一下.
我选用的是CHL细胞
１．低渗掖浓度是75mmol/L,体积是7mL,置于37度孵箱中作用30min
2. 预固定 假如固定掖(甲醇:冰醋酸=1:3)3mL,预固定10min 离心1500转 10min
3. 固定 固定掖(甲醇:冰醋酸=1:3)10mL,固定30min 固定两次 离心1500转 10min
4. 制片 距离15-20cm在冰片上滴片,并迅速过酒精灯火焰烘烤数次,置于37度孵箱中24小时后染色
结果观察:片中并未找到染色体,都是圆形的细胞,请问是否我哪里操作出问题了.我刚开始怀疑是低渗时间不够,但看了各位战友分享的经验,低渗应该也没有问题.请大家帮忙分析一下,谢谢!
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hongliling
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2011-08-29 14:26 消息 引用 收藏 分享
传几张我固定后所拍摄的细胞形态,是不是我低渗的力度还不够啊?
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蔷薇多多
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2011-09-19 18:56 消息 引用 收藏 分享
怎么没有人回答啊？我也想知道呢
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xiaonanhu
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2011-09-19 22:20 消息 引用 收藏 分享
我现在日本的一个医科大做研究，对染色体分析不熟悉，但前段时间在染色体诊断实验室看见他们做的染色体很长，G banding 很清晰，当时随便问了一下，好像是加thymidine后染色体会长一些。另外我看他们把玻片放在50度水浴槽内贴近水面，Tip头紧贴玻片滴片的，没从高处滴下，spreading也很漂亮。
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hongliling
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2011-09-23 15:52 消息 引用 收藏 分享
sunshijie12345 wrote:
谢谢各位的关注，最近我终于发现问题所在，以前配胰酶我用的是生理盐水，我现在换了磷酸缓冲液效果就好了！

现在对实验过程方法等有些了解了，以前对实验某些步骤有些误解，现在做了这么久，总算摸索到一些规律：

染色体实验的重点：

1.接种：成人接种20-25滴，四岁以下儿童接种的15滴，新生儿接种的10滴 （这个很好，很重要）

2.低渗：我们水浴低渗30分钟，低渗液0.075mol/l的kcl（37度30min绝对OK！）

3.固定：固定三次为好！（每次十分钟足矣。）

4.考片：80度2h-3h。

其它的什么天气湿度，滴片高度，干片或湿片等我都实验过，对染色体的制备都没什么影响！（请相信，这绝对至少亲自实验过3个月以上得出的结论。）

楼上的同学，低渗液不需要高压的，我们配500ML用半个月，效果没有影响。
请问你80度考片2-3小时的目的是什么呢?
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