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【原创】miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总 [精华]

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qwasd1234

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2010-06-01 14:30 浏览 : 134369 回复 : 347

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qwasd1234 编辑于 2014-11-25 10:15

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217楼

miRNA qPCR实验检测流程示例

一：概述

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR技术来对miRNA进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit来对miRNA进行检测的实验操作流程

二：背景资料

检测人脑组织中miRNA的表达。

所选的miRNA及其扩增长度信息如下：

	Primer ID	Mature_Acc	Mature_ID	PCR_SIZE
1	hsmq-0031_01	MIMAT0000069	has-miR-16	75
2	hsmq-0032_01	MIMAT0000422	hsa-miR-124	73
3	hsmq-0033_01	MIMAT0000443	hsa-miR-125a-5p	77
4	hsmq-0034_01	MIMAT0000423	hsa-miR-125b	75
5	hsmq-0035_01	MIMAT0000429	hsa-miR-137	76
6	hsmq-0036_01	MIMAT0000250	hsa-miR-139-5p	75
7	hsmq-0037_01	MIMAT0000437	hsa-miR-145	76
8	hsmq-0038_01	MIMAT0000450	hsa-miR-149	76
9	hsmq-0039_01	MIMAT0000439	hsa-miR-153	75
10	hsmq-0040_01	MIMAT0000452	hsa-miR-154	75
11	hsmq-0041_01	MIMAT0000259	hsa-miR-182	77
12	hsmq-0042_01	MIMAT0000261	hsa-miR-183	75
13	hsmq-0043_01	MIMAT0000458	hsa-miR-190	75
14	hsmq-0044_01	MIMAT0000276	hsa-miR-219-5p	74
15	hsmq-0045_01	MIMAT0000077	hsa-miR-22	75
16	hsmq-0046_01	MIMAT0000082	hsa-miR-26a	75
17	hsmq-0047_01	MIMAT0000100	hsa-miR-29b	76
18	hsmq-0048_01	MIMAT0000244	hsa-miR-30c	76
19	hsmq-0049_01	MIMAT0000441	hsa-miR-9	76
20	hsmq-0050_01	MIMAT0000689	hsa-miR-99b	75
21	hsnRNA-U6_01	M14486	hsnRNA-U6	81

三：实验内容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”处理、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析

四：实验主要仪器和试剂

主要实验仪器

冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统 iQ5 Real Time PCR Detection System

主要实验试剂

TRIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、 miRNA qRT-PCR Detection Kit：GeneCopoeia (Cat. No. AOMD-Q050 )

五：实验操作

前期准备

为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行

利用miRNA qRT-PCR Detection Kit进行实验检测的流程示意图

图1：miRNA qPCR Detection流程示意图

Total RNA抽提

样品处理

取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞。

（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×10⁷细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为悬浮细胞，离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×10⁷细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞）。
相分离

室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。
RNA沉淀

小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。
RNA洗涤

去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。
RNA溶解

风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。
RNA浓度测定

吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。

Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD₂₆₀×稀释倍数）
RNA电泳检测

7.1 变性胶制备

取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
7.2 电泳缓冲液配制(1×Mops)

取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中
7.3 RNA样品处理

取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳
7.4 RNA电泳

先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。

RNA抽提结果

8.1. RNA电泳图（取3ul RNA 样品）：
8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀
RNA来源 RNA浓度(ng/μL ) OD₂₆₀/OD₂₈₀
人脑组织 3470 1.90

miRNA 3’端进行加“Poly A”处理

融解加“PolyA”反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
PolyA Reaction 反应液的配制在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μL
试剂组分体积终浓度
Total RNA 2μg
2.5U/μLPolyA Polymerase 1μL 2.5U
10×PolyA Polymerase Buffer 2μL 1×
10×rATP Solution 2μL 1×
ddH₂O(RNase/DNase free) 补至20μL

在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。Total RNA使用量可在100ng～10μg之间调整，如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之间调整。
PolyA反应

混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应15min。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃。

Poly A化的RNA进行反转录反应

融解反转录反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
RNA-Primer Mix 的配制反应在冰上预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL
试剂组分体积终浓度
PolyA反应液 2μL
25×Oligo dT Adaptor 1μL 1×
ddH₂O(RNase/DNasfree) 10μL
Final Volume 13μL

混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，直接65℃变性10min后立即放置冰上至少2min。

配制反转录反应液在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL。

试剂组分	体积	终浓度
RNA-Primer Mix	13μL
5×RT Reaction Buffer	5μL	1×
25mM dNTP	1μL	1mM
25U/μL RNase Inhibitor	1μL	25U
200U/μL M-MLV RTase (RNase H free)	1μL	200U
ddH2O(RNase/DNase free)	4μL
Final Volume	25μL

反转录反应

混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60min, 再进行85℃ 5min灭活处理。所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。

qPCR 检测miRNA.

miRNA检测引物设计

miRNA qRT-PCR Detection Kit中已提供有miRNA检测的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，Forward 检测引物需客户参考miRNA序列自行设计或直接从我公司定购以验证的引物。因为miRNA序列长度一般都在18～24nt之间，所以其检测的Forward 检测引物一般都直接选用其miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚体，其引物可为miRNA 3’端去除几个碱基后整理的序列。
miRNA qPCR Forward Primer 设计举例（以小鼠mmu-miR-125b-5p为例）：

在miRNA Database中查找检测的miRNA序列，如下图所示：miRNA Database：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL

则其Forward 检测引物可为：
miRNA sequence ucccugagacccuaacuuguga
Primer sequence tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）
融解2×AllinOne^TM qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

冰上进行qPCR反应液的配制（所有miRNA进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No template control）测试）

试剂组分	体积	终浓度
2×AllinOne^TM qPCR Mix	10μL	1×
qPCR Forward Primer（2μM）	2μL	0.2μM
Universal Adaptor PCR （2μM）	2μL	0.2μM
1st strand cDNA（diluted 1:5）	2μL
ddH₂O	4μL
Final Volume	20μL

2×AllinOne^TM qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
Rox Reference Dye 使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。
引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
1^st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用，防止反转录体系对qPCR体系的影响。

充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。
qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）
循环数步骤温度时间检测
1 预变性 95℃ 10min 否
变性 95℃ 10sec 否
40 退火 57℃ 20sec 否
延伸 72℃ 10sec 是
对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析（以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计）
检测温度范围升温速率恒温时间检测
70℃～95℃ 0.5℃/次 6 sec/次是
30℃ 30sec 否

2×AllinOne^TM qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
因miRNA的特殊性从而导致了其引物的特殊性，在检测时应严格控制退火温度，防止出现非特异性扩增。
进行反转录的Oligo dT Adaptor其长度为53nt，为此PCR扩增得到的片段长度一般在75bp左右（miRNA序列一般为22nt左右），所以延伸只需10sec即可。对产物的融解曲线判断可以发现其Tm值一般都在79℃～83℃范围内，如果超出此范围，建议使用别的方法来验证产物的特异性（如电泳）。

六:结果分析

20个miRNA及其内参U6的扩增曲线及其融解曲线结果
融解曲线图扩增曲线图

20个miRNA及其内参U6的电泳结果图及其检测原始平均Ct值

	Primer ID	Mature_ID	PCR_SIZE	组织	Sample Ave. Ct	胶泳道
1	hsmq-0031_01	has-miR-16	75	脑	27.02	1
2	hsmq-0032_01	hsa-miR-124	73	脑	22.98	2
3	hsmq-0033_01	hsa-miR-125a-5p	77	脑	27.81	3
4	hsmq-0034_01	hsa-miR-125b	75	脑	22.58	4
5	hsmq-0035_01	hsa-miR-137	76	脑	28.51	5
6	hsmq-0036_01	hsa-miR-139-5p	75	脑	30.66	6
7	hsmq-0037_01	hsa-miR-145	76	脑	24.7	7
8	hsmq-0038_01	hsa-miR-149	76	脑	29.71	8
9	hsmq-0039_01	hsa-miR-153	75	脑	27.61	9
10	hsmq-0040_01	hsa-miR-154	75	脑	30.39	10
11	hsmq-0041_01	hsa-miR-182	77	脑	34.64	11
12	hsmq-0042_01	hsa-miR-183	75	脑	33.86	12
13	hsmq-0043_01	hsa-miR-190	75	脑	32.28	13
14	hsmq-0044_01	hsa-miR-219-5p	74	脑	28.16	14
15	hsmq-0045_01	hsa-miR-22	75	脑	24.09	15
16	hsmq-0046_01	hsa-miR-26a	75	脑	22.66	16
17	hsmq-0047_01	hsa-miR-29b	76	脑	26.72	17
18	hsmq-0048_01	hsa-miR-30c	76	脑	26.54	18
19	hsmq-0049_01	hsa-miR-9	76	脑	23.11	19
20	hsmq-0050_01	hsa-miR-99b	75	脑	27.06	20
21	hsnRNA-U6_01	M14486	81	脑	22.26	21

2012-04-13 12:14

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lu_xinhua1

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71楼

推荐miRNA检测的一种Taqman 水解探针法。
作者采用了罗氏的探针，特异性比不上ABI的，但是成本和sybgreen的价格差不多，效果要比sybgreen好很多。

目前市场上面 ABI的Taqman miRNA 是miRNA 检测的金标准。

另外常用的还有基于 stem-loop的（stem loop 是ABI的专利，所以正规的大公司都不会有Stem loop的试剂盒）
1. Sybgreen方法（客户群最多，但是效果不稳定）
2. 自行设计的Taqman方法（由于合成的探针是国内的普通探针大概20多个bp比ABI的MGB探针至少要多出6个bp，再加上引物常常会把miRNA挤的很满）

基于加尾方法的
1. Qiagen公司的试剂
2. Exiqon公司的试剂采用了锁核酸技术同时有人的全miRNA基因表达芯片产品