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植物与农林科学
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【求助】PCR实验的退火温度怎么确定？
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什么是真理
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丁当
1楼
这个帖子发布于
10年零356天
前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
在做PCR的过程中，是否和cDNA引物有关？怎么确定其的退火温度？
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不知道邀请谁？试试他们
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2010-03-19 13:15
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深圳无编制全科医生-每个月拿着1万块钱收入看着10万元/平方房价，心如死灰。
zhangnrg
心血管病研究所
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丁当
2楼
我只是一个本科生，我们老师是这样说的。
退火温度=Tm-5
Tm=4(G+C)+2(A+T)
我能力有限，希望能对你有所帮助。
2010-05-10 19:40
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谁家超声科值夜班是24小时都在医院上班？
pcrzzz
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丁当
3楼
根据上下游引物确定，可以设置几个梯度，用梯度PCR扩增后，电泳看哪个温度合适。
2010-05-30 12:08
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仅以此LC篇献给自己，警醒自己，以及未来的战友们
lk9908
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丁当
4楼
退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
2010-06-01 11:37
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