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常驻站友

427楼

请教楼主
我们用CHO-K1细胞表达的RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清，加入5%体积的1M tris-hcl （pH 8.0 & pH 9.0）后过GE protein G 预装柱，目的蛋白均不挂柱。我们又将少量RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清直接用pH 7.2-7.4的PBS透析后过protein G 预装柱，仍然不结合。

2012-01-05 14:34

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楼主

laboy

铁杆站友

428楼

4841686
请教楼主
我们用CHO-K1细胞表达的RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清，加入5%体积的1M tris-hcl （pH 8.0 & pH 9.0）后过GE protein G 预装柱，目的蛋白均不挂柱。我们又将少量RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清直接用pH 7.2-7.4的PBS透析后过protein G 预装柱，仍然不结合。

信息很少

我觉得可以试试proteinA

另外纯化前后的各个样品组分（原液，流穿，上样后洗柱子的平衡液，洗脱液）跑个电泳，有条件再做个ELISA看下

抗体究竟都在哪

2012-01-09 13:41

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4841686

常驻站友

429楼

laboy
信息很少

我觉得可以试试proteinA

另外纯化前后的各个样品组分（原液，流穿，上样后洗柱子的平衡液，洗脱液）跑个电泳，有条件再做个ELISA看下

抗体究竟都在哪

我们对过柱后上清进行了ELISA检测，可以确定绝大部分蛋白未能挂柱，仍在过柱后上清里面。
同时尝试使用proteinA预装柱进行实验，蛋白依旧未能挂柱。

目前的主要症结是不结合柱子，是否需在过柱上清里加些Nacl？请教楼主

2012-01-10 14:31

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楼主

laboy

铁杆站友

430楼

4841686
我们对过柱后上清进行了ELISA检测，可以确定绝大部分蛋白未能挂柱，仍在过柱后上清里面。
同时尝试使用proteinA预装柱进行实验，蛋白依旧未能挂柱。

目前的主要症结是不结合柱子，是否需在过柱上清里加些Nacl？请教楼主

假设你的试验本身都没问题，如果连A和G都挂不了柱，那说明你表达的蛋白的FC结构有问题，要么是异构错构，要么是被蛋白折叠遮挡。

为什么不表达完整IgG蛋白?

如果没有发生这种悲剧的根本性错误，那就是试验操作本身吧

但是proteinA的亲和纯化是一种很宽容的实验，随便FC都能挂住的，制药FC是完好正确的，如果基本挂不住的，你加什么都没用。

2012-01-11 11:32

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