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蛋白质和糖学

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论坛首页  >  蛋白质和糖学技术讨论版   >  蛋白表达纯化
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【兴趣小组】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖,欢迎路过 [精华]

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楼主 laboy
laboy
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这个帖子发布于10年零364天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
2009年丁香园的得分统计中,竟然没有一个精品帖子是我发的(虽然参与了很多),惭愧ing

为了杯具不再发生,也是向坛子里chromatography等前辈学习,斗胆发此贴,和大家分享经验和教训:p

在学校做了2年,在一家抗体公司做了5年多的抗体和抗原纯化,经过我的手或者下面员工的手,纯化过的抗体不下几千个了,如果以重量计估计要以斤算……

单抗,多抗

IgG IgM IgY

上清 血清 腹水 蛋黄

疏水 抗原免疫亲和 嗜硫 proteinA proteinG 硫酸铵沉淀 辛酸萃取

……
都做过一些

在抗体纯化或者抗体相关技术方面有需要帮助的战友们(也时常有战友私下发短消息给我,不如发出来,大家一起讨论),欢迎发帖来讨论,大家互相学习,共同提高

考虑到很多新接触抗体纯化的朋友,都问我要protocol,我就上传一个最基础也是最经典的handbook吧

推荐这个GE公司的 《antibody handbook》不代表我推荐里面的所有试剂和设备。
纯化不是做衬衣,没有万金油protocol

  • 18103746AC.pdf(1077.25k)
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    换一换
2010-01-26 16:41 浏览 : 86738 回复 : 504
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laboy 编辑于 2011-11-09 14:51
  • • 酚酞片严重不良反应被禁用?你了解吗?
笑百
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我最近也在做抗体纯化,正苦于没人问。看来楼主是抗体纯化的高手啊,以后要多请教了。

先问个问题,从血清纯化IgG,需要经过哪些纯化步骤?我现在是用辛酸-硫酸铵沉淀,然后过DEAE-纤维素阴离子交换柱,感觉效果不太好。
2010-01-26 17:30
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楼主 laboy
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笑百
我最近也在做抗体纯化,正苦于没人问。看来楼主是抗体纯化的高手啊,以后要多请教了。

先问个问题,从血清纯化IgG,需要经过哪些纯化步骤?我现在是用辛酸-硫酸铵沉淀,然后过DEAE-纤维素阴离子交换柱,感觉效果不太好。

高手不敢当啊,就是纯化过不少抗体而已
纯化抗血清,如果有纯抗原(0.5mg以上)都推荐做抗原免疫亲和纯化,其次是proteinA的亲和纯化。再其次是用硫酸铵分级沉淀。
2010-01-27 08:11
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skykiller
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本来我很有些反对那个年终排名的,没想到能把laboy引出来开这个帖子,有幸!

关于抗体纯化,看起来很简单,protocol一堆一堆的,当然,如果只是纯化一点少量抗体做试验室的试验用,抗体纯化很简单。

但实际上做过几十个或上百个以上抗体纯化的老手就会知道,抗体纯化不简单!甚至比那些大肠杆菌表达的重组蛋白要难。做商品化应用的抗体纯化同行们也有此体会吧?
难有几个方面。

例如原料的差异。无论是单抗腹水还是多抗血清,不能保证每批原料的相同,有时候甚至差异很大。当一批纯化抗体出现问题时,是原料原因引起还是纯化过程引起的排查就很有得受。而重组的E.Coli.或酵母蛋白相对要均一性的多。

例如抗体活性的保持。对重组E.Coli.或酵母蛋白,如果是可溶蛋白,其活性往往较稳定,只要不降解,变化不大。而抗体却表现的很微妙。缓冲液、温度或纯化用柱的细微变化往往会带来差异较大的结果。

非常高兴laboy开这个帖子。我先来问一个问题。
在单抗腹水前处理过程中,由于免疫方式的不同,有些腹水往往含有较多的石蜡油,造成过滤困难,而且会堵纯化的在线过滤器和柱头,也会粘附在纯化胶上,如何通过前处理过程去除呢?希望对抗体的损失不大。
2010-01-27 08:59
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